ליסטריה דלקת של המוח
Summary
במהלך זיהום, ליסטריה הוא מסוגל לחצות את מחסום הדם – מוח ליישב את המוח. ב פרוטוקול זה, נדגים כיצד להעריך מושבת חיידקים של איברים בעקבות זיהום של עכברים. הליך כדי לבצע כל האיבר זלוף לקביעת ספציפי של חיידקי מספרים ב- parenchyma המוח מסופק.
Abstract
ליסטריה הוא פתוגן חיידקי תאיים, אשר קשורה לעיתים קרובות עם זיהום שמקורם במזון. היכולת של ל’ monocytogenes לחצות את מחסום הדם – מוח (BBB) היא בנוגע כמו זה יכול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח, דלקת קרום המוח. BBB מגן microenvironment למוח את מטבוליטים רעילים שונים של חיידקים פתוגנים נמצאו בדם בעקבות זיהום, לכן תומך המוח הומאוסטזיס. המנגנון שבאמצעותו ל’ monocytogenes נוכח הדם חוצה BBB לגרום למוח זיהומים אינם מובנים במלואם, ויש גם חוסר מערכת מודל חזקים ללמוד זיהומים במוח על-ידי monocytogenes ל’. כאן, אנו מציגים מודל זיהום עכבר פשוטות כדי לקבוע אם חיידקים חצו BBB וכדי quantitate את הנטל של חיידקים כי השתלטו על המוח בתוך vivo. בשיטה זו, היו נגועים לווריד ל’ monocytogenes וחיות היו מורדמים בצורה אנושית על ידי חשיפה CO2 ואחריו נקע בצוואר הרחם. זלוף הלב של בעלי החיים בוצעה לפני קצירת האיברים הנגועים. דם נאסף לפני זלוף, המספר של חיידקים לכל איבר או מ”ל של דם נקבע על ידי ציפוי דילולים של homogenates דם או איברים על פלטות אגר והקים ספירת מספר מושבות. בשיטה זו ניתן ללמוד אינטראקציות קולטן הרומן-ליגנד זיהום של המוח על ידי ל’ monocytogenes ולשפר ניתן להתאים בקלות לצורך המחקר של פתוגנים חיידקיים רבים.
Introduction
חיידק גראם חיוביים ליסטריה הוא. חיידק תאיים עיצוב גבות ואחד הכי קטלני המועבר במזון פתוגנים ברחבי העולם. בליעה של ל’ monocytogenes שזוהמו מזון יכול להוביל ליסטריוסיס בבני אדם, מחלה פולשנית קשה מיקוד נשים בעיקר בהריון, תינוקות, של אנשים זקנים, וגם immunocompromised1. Monocytogenes ל’ היא בין הגורמים המובילים. למוות חיידק המועבר במזון בארה ב, שיעורי התמותה במקרה של ליסטריוסיס גבוה כמו 20-30%, הגבוה ביותר עבור פתוגנים שמקורם במזון כל2. אין חיסון כיום קיימת monocytogenes ל’ , היכולת של החיידקים כדי להפיץ ביעילות איברים דיסטלי והמוח מאת לחצות את מחסום הדם – מוח (BBB) עלול להוביל סכנת חיים דלקת קרום המוח ו קולוניזציה של המוח3 , 4 , 5 , 6. דלקת קרום המוח היא בדרך כלל חמורה; בעוד רוב האנשים המקבלים טיפול להתאושש, זיהומים יכול לגרום לסיבוכים רציניים, למשל, נזק מוחי, אובדן שמיעה או ליקויי למידה אצל ילדים. Monocytogenes ל’ הוא חזה לקחת בחשבון לפחות 10% של כל קהילה רכשה דלקת קרום המוח ארה ב7.
כביש מרכזי עבור הפצת החיידק אל המוח ואל קרומי המוח היא דרך מחזור הדם. חיידקים במחזור הדם במוח מסוגלים לעבור BBB לגרום דלקת המוח. BBB היא מערכת מאוד vascularized מכשול זה מגן על המוח מפני חלקיקים זרים במחזור הדם. תאי אנדותל מהווים שכבה המרפדת את השטח הפנימי של כלי הדם8,9. בנוסף monocytogenes ל’, מספר פתוגנים חיידקיים כגון מנינגוקוקוס, סטרפטוקוקוס pneumoniae, Escherichia coliו Haemophilus influenzae סוג b (Hib) מסוגלים להמדינות המוח על ידי חציית5,64,3,BBB. עם זאת, כאשר בוחנים את הנטל חיידקי במוח של עכברים נגועים, חשוב לקבוע שאם חיידקים חצו BBB, אחרת הנטל חיידקי במוח עשוי לייצג חיידקים שעדיין נמצאים כלי הדם של המוח. לפיכך, יש צורך perfuse העכברים של כל הדם לפני קביעת המושבה יוצרי יחידות (CFU) של המוח homogenates.
במחקר זה, אנו מתארים ויוו שיטות לבחון ל’ monocytogenes זיהום של המוח. בשיטות המתוארות כאן, השתמשנו ל’ monocytogenes זן 10403S. Monocytogenes ל’ 10403S הוא אחד של זנים המעבדה הנפוצה ביותר ללמוד ליסטריוסיס מערכתית במודל עכבר של זיהום10. פרוטוקול זה מבוסס על תקן ורידיות ל’ monocytogenes ואחריו זלוף של העכברים. קו מיתאר סכמטי של פרוטוקול זיהום בעכברים מוצג באיור1. Monocytogenes ל’-המוח נגוע ואיברים אחרים של עכברים ללא perfused או perfused נאספו וקבעה הנטל איברים חיידקי. שיטות אלה הם שימושיים לא רק בקביעת מושבת חיידקים הכולל של המוח אצל בעלי חיים נגועים, אך יש גם מועיל לקביעת אם חיידקים יש שחדר ה BBB ויוו לתווך הפלישה של המוח. חשוב להדגיש כי פרוטוקול המעבדה זה צריך להתנהל בעקבות התייעצות עם הוועדה אבטחה מוסדיים הרלוונטיים וניהול מתקן חיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monocytogenes ל’ הוא מסוגל לגרום סכנת חיים meningoencephalitis בני אדם. מחקרים קודמים הראו את היכולת של חיידקים לחצות את-מחסום הדם המוח-(BBB) ליישב את המוח. שלושה מסלולים הפלישה למוח. הוצעו במהלך זיהום: ישיר חדירה של BBB על ידי חיידקים, התגנבות תעבורה על-ידי חיידקים הכלול בתוך תאי תאי3והעברה ע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי שירות בריאות הציבור האמריקני מענק AI103806 של מכוני הבריאות הלאומיים.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
