الليستريه المستوحدة التهاب الدماغ
Summary
خلال العدوى، الليستريه المستوحدة قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ لاستعمار الدماغ. في هذا البروتوكول، ونحن لشرح كيفية تقييم الاستعمار الجرثومي للأجهزة بعد إصابة فئران. ويرد إجراء لأداء الجهاز كله نضح لتصميم محددة من أرقام البكتيرية في حمة الدماغ.
Abstract
الليستريه المستوحدة من مسببات الأمراض بكتيرية داخل الخلايا التي كثيرا ما يرتبط بالعدوى المنقولة عن طريق الأغذية. قدرة لام الليستريه على عبور حاجز الدم في الدماغ (بي بي بي) المتعلقة بأنها يمكن أن تؤدي إلى التهاب السحايا والتهاب الدماغ مهددة للحياة. بي بي بي يحمي المكروية الدماغ من مختلف نواتج الأيض السامة ومسببات الأمراض الميكروبية الموجودة في الدم بعد الإصابة، ويدعم ذلك التوازن في الدماغ. أن الآليات التي لام الليستريه موجودة في مجرى الدم عبر BBB التسبب في الدماغ العدوى ليست مفهومة فهما كاملا وهناك أيضا الافتقار إلى نظام نموذجي قوية لدراسة التهابات الدماغ لام الليستريه. هنا، نحن نقدم نموذج عدوى ماوس بسيطة لتحديد ما إذا كانت البكتيريا قد عبرت بي بي بي وكوانتيتاتي عبء البكتيريا التي قد استعمرت الدماغ في فيفو. في هذا الأسلوب، الحيوانات أصيبوا عن طريق الوريد مع الليستريه ل. وقد euthanized معاملة إنسانية بالتعرض لأول أكسيد الكربون2 متبوعاً بخلع عنق الرحم. وأجرى التروية القلبية للحيوانات قبل حصادها الأجهزة المصابة. تم جمع الدم قبل التروية ويتحدد العدد من البكتيريا في الجهاز أو مل من الدم تصفيح تخفيف هوموجيناتيس الدم أو الجهاز على ألواح أجار وإحصاء عدد المستعمرات وشكلت. يمكن استخدام هذا الأسلوب لدراسة التفاعلات يجند مستقبلات الرواية التي تعزز الإصابة بالدماغ لام الليستريه ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة مسببات الأمراض البكتيرية متعددة.
Introduction
هو بكتيريا إيجابية الليستريه المستوحدة ممرض داخل الخلايا اختياري وواحد مسببات معظم القاتل المنقولة بالأغذية في جميع أنحاء العالم. ابتلاع الطعام لام الليستريه الملوثة يمكن أن يؤدي إلى داء الليستَريات في البشر، وهو مرض الغازية شديدة تستهدف معظم الحوامل، والأطفال حديثي الولادة، والأفراد المسنين، والمناعة1. لام الليستريه من بين الأسباب الرئيسية للوفاة بالممرضات المنقولة بالأغذية في الولايات المتحدة، ومعدلات الوفاة من داء الليستَريات يصل إلى 20-30 ٪، أعلى لجميع مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية2. حاليا لا يوجد لقاح لام الليستريه وقدرة البكتيريا على فعالية وامتدت إلى الأجهزة البعيدة والدماغ بعبور حاجز الدم في الدماغ (BBB) قد تؤدي إلى التهاب السحايا مهددة للحياة واستعمار الدماغ3 , 4 , 5 , 6-التهاب السحايا الجرثومي عادة شديدة؛ الإصابات أثناء استرداد معظم الناس الذين يتلقون العلاج، يمكن أن يسبب مضاعفات خطيرة مثل، وتلف الدماغ، وفقدان السمع أو إعاقات التعلم في الأطفال. ومن المتوقع لام الليستريه لحساب 10 في المائة على الأقل من كل المجتمع اكتسب التهاب السحايا في الولايات المتحدة7.
طريقا رئيسيا لنشر البكتيريا إلى الدماغ والسحايا من خلال مجرى الدم. البكتيريا المتداولة في الأوعية الدموية في الدماغ قادرة على عبور BBB يسبب التهاب الدماغ. بي بي بي هو نظام حاجز vascularized العالية التي تحمي الدماغ من الجسيمات الأجنبية المتداولة في الدم. خلايا بطانية تشكل طبقة خطوط سطح الداخلية ل الأوعية الدموية8،9. وبالإضافة إلى لام الليستريه، مسببات الأمراض البكتيرية متعددة مثل وجود النيسرية السحائية، العقدية الرئوية، الإشريكيّة القولونية، و النزلة النزفية من النوع باء (Hib) قادرون على استعمار الدماغ بعبور ال بي بي بي3،4،،من56. ومع ذلك، عند دراسة أعباء البكتيرية في دماغ الفئران المصابة، من المهم لتحديد ما إذا كانت البكتيريا عبروا BBB، خلاف ذلك عبء البكتيرية في الدماغ قد تمثل البكتيريا التي لا تزال في الأوعية الدموية للمخ. وبالتالي، من الضروري أن نتخلل الفئران من كل الدم قبل تحديد الوحدات المكونة للمستعمرة (زيمبابوي) من هوموجيناتيس الدماغ.
في هذه الدراسة، يصف لنا في فيفو أساليب دراسة العدوى الليستريه لام المخ. للأساليب الموصوفة هنا، استخدمنا لام الليستريه سلالة 10403S. المستوحدة ل. 10403S واحد من سلالات المختبر الأكثر استخداماً لدراسة داء الليستَريات النظمية في طراز الماوس من عدوى10. ويستند هذا البروتوكول الحقن القياسية لام الليستريه يليه نضح الفئران. ويرد في الشكل 1ملخص تخطيطي البروتوكول العدوى في الفئران. لام الليستريه-جمعت العقول المصابة والأجهزة الأخرى من الفئران غير perfused أو perfused وتحديد عبء الجهاز الجرثومي. هذه الأساليب هي مفيدة ليس فقط تحديد مجموع استعمار الدماغ في الحيوانات المصابة بالعدوى البكتيرية، ولكن هي أيضا مفيدة لتحديد ما إذا كانت البكتيريا قد تغلغلت في بي بي بي في فيفو التوسط من أجل غزو الدماغ. من المهم تسليط الضوء على أنه ينبغي أن تجري هذا البروتوكول المختبر بعد التشاور مع إدارة مرفق اللجنة والحيوان في السلامة المؤسسية ذات الصلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
المستوحدة لام غير قادرة على تسبب التهاب السحايا والدماغ مما يهدد حياة البشر. الدراسات السابقة أثبتت قدرة البكتيريا عبر الدم-الدماغ-الجدار (BBB) واستعمار الدماغ. وقد اقترحت ثلاث طرق لغزو الدماغ أثناء الإصابة: مباشرة اختراق BBB بالبكتيريا، والنقل خلسة بواسطة البكتيريا الواردة داخل الخلا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان تدعمها “خدمة الصحة العامة في الولايات المتحدة” منح AI103806 من “المعاهد الوطنية للصحة”.
Materials
| Brain Heart Infusion media | Becton Dickinson | 237200 | |
| Streptomycin sulfate | Amresco | 0382-50G | |
| Petri dishes | VWR | 25384-342 | |
| Glycerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Basic Homogenizer | IKA | 3352109 | Model: T18BS1 |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter | DU 800 series | |
| BALB/c mice | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| 1 mL syringes | Becton Dickinson | 309659 | |
| 26-gauge needles | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21-gauge butterfly needles | Becton Dickinson | 367281 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 21008-918 | |
| Round-bottom test tubes | VWR | 60819-546 | |
| Phosphate-buffered saline | Corning | 46-013-CM | |
| Stainless steel spatula | VWR | 82027-520 | |
| Stainless steel scissors (6.5 in) | VWR | 82027-592 | |
| Stainless steel scissors (4.5 in) | VWR | 82027-578 | |
| Stainless steel blunt forceps (4.5 in) | VWR | 82027-440 | |
| Stainless steel fine tip forceps (6 in) | VWR | 82027-406 |
References
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of listeriosis: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Infectious Diseases. 14 (11), 1073-1082 (2014).
- Drevets, D. A., Leenen, P. J., Greenfield, R. A. Invasion of the central nervous system by intracellular bacteria. Clinical Microbiology Reviews. 17 (2), 323-347 (2004).
- Huang, S. H., Stins, M. F., Kim, K. S. Bacterial penetration across the blood-brain barrier during the development of neonatal meningitis. Microbes and Infection. 2 (10), 1237-1244 (2000).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology, diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clinical Microbiology Reviews. 23 (3), 467-492 (2010).
- Thigpen, M. C., et al. Bacterial meningitis in the United States, 1998-2007. New England Journal of Medicine. 364 (21), 2016-2025 (2011).
- Durand, M. L., et al. Acute bacterial meningitis in adults. A review of 493 episodes. The New England Journal of Medicine. 328 (1), 21-28 (1993).
- Disson, O., Lecuit, M. Targeting of the central nervous system by Listeria monocytogenes. Virulence. 3 (2), 213-221 (2012).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412 (2015).
- Becavin, C., et al. Comparison of widely used Listeria monocytogenes strains EGD, 10403S, and EGD-e highlights genomic variations underlying differences in pathogenicity. MBio. 5 (2), e00969-e00914 (2014).
- Kirchner, M., Higgins, D. E. Inhibition of ROCK activity allows InlF-mediated invasion and increased virulence of Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology. 68 (3), 749-767 (2008).
- Grubaugh, D., et al. The VirAB ABC transporter is required for VirR regulation of Listeria monocytogenes virulence and resistance to nisin. Infection and Immunity. 86 (3), 901-917 (2018).
- Vazquez-Boland, J. A., et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinants. Clinical Microbiology Reviews. 14 (3), 584-640 (2001).
- Ghosh, P., et al. Invasion of the brain by Listeria monocytogenes is mediated by InlF and host cell vimentin. MBio. 9 (1), e00160-e00118 (2018).
- Henke, D., et al. Listeria monocytogenes spreads within the brain by actin-based intra-axonal migration. Infection and Immunity. 83 (6), 2409-2419 (2015).
- Maury, M. M., et al. Uncovering Listeria monocytogenes hypervirulence by harnessing its biodiversity. Nature Genetics. 48 (3), 308-313 (2016).
