Determinante 3'-Termini y secuencias de las moléculas de ADN Viral naciente en HIV-1 Reverse transcripción en células infectadas

Nota: Consulte la Tabla de materiales reactivos específicos y equipos utilizados en el presente Protocolo. 1. virus de la producción y la infección de células PRECAUCIÓN: Infecciosas VIH-1 debe manipularse sólo en laboratorios de contención de bioseguridad aprobados. Nota: La producción de partículas VIH-1 por transfección transitoria de riñón embrionario humano (HEK) 293T células, como se describe en paso 1.1, es un procedimiento estándar y ha sido descrito previamente15,16. Cultura general de la célula son procedimientos descrito anteriormente17. Producción del virus VIH-1. Mantener las células 293T de Dulbecco modificación medio de Eagle (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina/estreptomicina (DMEM completo) en una incubadora de cultura de célula estándar a 37 ° C y 5% CO2 como se describe anteriormente17. En una campana de flujo laminar estándar tejido cultura Retire el medio de crecimiento y añadir 3 mL de tripsina precalentado (37 ° C) a una placa de cultivo de célula 10 cm cerca del confluente (~1.2 x 107 células) de las células 293T. Volver a poner el plato en la incubadora durante 2-3 minutos. Llevar el plato de la incubadora en la campana de cultivo de tejidos y Añadir 7 mL de medio completo. Pipetee hacia arriba y hacia abajo en el plato varias veces para resuspender las células. Dividir las células 1:4 añadiendo 2.5 mL de la suspensión de células a un nuevo plato de 10 cm y rellenarlo con 7,5 mL de medio completo. Al día siguiente, 10 μg de plásmido de HIV-1 proviral DNA (como pNL4.3) de la mezcla con 1 mL de medio esencial mínimo libre de suero y agregar solución de polietilenimina (PEI) (25.000 mW, 1 mg/mL pH 7) en 4.5 μL 1 μg de ADN. Incubar por 10 min a temperatura ambiente y añadir gota a gota a las células 293T. 24 h después de la transfección, quitarlo del medio y reemplazarlo con 6 mL de DMEM completo que contengan libre de Rnasa DNasa en medio 20 de U/mL. Después de 6 h, sustituir el medio con 10 mL de DMEM completo. 48 h después de la transfección, coseche el sobrenadante y filtrar con un filtro de 0,22 μm, usando una jeringa de 10 mL en un tubo de polipropileno de 15 mL. Añadir 2 mL de sacarosa al 20% estéril de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) a un tubo abierto de paredes delgadas ultracentrífuga. Lentamente el recubrimiento la sacarosa con el sobrenadante filtrado de la célula. Centrifugar durante 1 h 15 min a 134.000 x g a 4 ° C utilizando una ultracentrífuga. Retirar cuidadosamente los tubos de la ultracentrífuga. Poco a poco sacar el sobrenadante y sacarosa con una aspiración o una pipeta. Utilice una pipeta más pequeño y el tubo de la inclinación al sacar la última solución de sacarosa. Deje el virus sedimentado en el fondo del tubo.Nota: La pastilla no será visible. Añadir 200 μL de PBS 1 x, dejar en la nevera de 4 a 12 h, suspender y congelar en alícuotas de μl 20 a-80 ° C. Determinar p24Gag contenido utilizando la un antígeno p24 de VIH-1 ELISA kit (siguientes instrucciones). Infección de la línea del T-cell. Una línea de células T inmortalizada de la cultura (por ej., células CEM-SS) en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina (RPMI completo). Contar las células usando un hemocitómetro18 y semilla 1 bien por la muestra con 1 mL de RPMI completo con 2 x 106 células/mL en una placa de cultivo celular de formato 12-bien. Añadir partículas de VIH-1 equivalente a 150 ng p24Gag y coloque el plato en un balanceo centrífuga cubo con tapas de biocontención para infectar a la vuelta por centrifugación en una centrífuga de sobremesa para 2 h a 2.000 x g a 30 ° C. Extraiga la placa de la centrifugadora y se deja reposar durante 1 hora en una incubadora de cultivo de tejidos estándar a 37 ° C y 5% CO2. Para limpiar virus de entrada, recogen las células por las suspensiones de células de transferencia a tubos de microcentrífuga y centrifugación en una microcentrífuga en RT (RT) a 500 x g durante 2 min. Sacar el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares. Resuspender el pellet celular en 1 mL de precalentado (37 ° C), estéril de 1 x PBS. Repetir la centrifugación, extracción sobrenadante y resuspensión pasos dos veces más. Centrifugar nuevamente, quite el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1 mL de RPMI completo. Añadir cada suspensión a un pozo en una nueva placa bien 12. En el post inicial además de 6 h del virus (centrifugación después de 4 h), cosechar las células por centrifugación como hecho en el paso 1.2.4. Retire y descarte el sobrenadante. Los pellets de células pueden ser congelados a-80 ° C o procesados directamente para la extracción de ADN. 2. ADN extracción, cuantificación de ADN de VIH-1 y enriquecimiento por captura de híbridos Extraer ADN de células enteras con un tejido y sangre total DNA kit de extracción, siguiendo el manual de kit de cultivo de tejidos las células. El único cambio es la elución en 200 μL de H libre de nucleasa2O en lugar del tampón de elución proporcionada.Nota: Después de la adición del tampón de lisis caotrópico (del kit “AL buffer”) y proteinasa, muestras pueden ser extraídas del laboratorio de contención de bioseguridad y manejadas en un laboratorio de nivel de seguridad estándar para el resto del protocolo. Determinar el número de copia del cDNA de VIH-1 por qPCR. 17 μl de eluido en el paso 2.1 y añadir 2 μl de buffer de enzima de la restricción de x 10 con 1 μl de enzima de la restricción de DpnI. Incubar durante 1 h a 37 ° C para eliminar cualquier potencial residual entrada ADN plásmido de transfección. Realización de qPCR para filamento menos fuerte parada cDNA usando el siguiente conjunto de sonda de cartilla: oHC64 (5-taactagggaacccactgc-3 ‘) y oHC65 (5-gctagagattttccacactg-3 ‘) y sonda oHC66 (5′-FAM-acacaacagacgggcacacacta-TAMRA-3 ‘). configuración de qPCR y condiciones exactas pueden encontrarse en las referencias6,13. Llevar a lo largo de las muestras con una dilución seriada del plásmido proviral pNL4.3 como una curva estándar para determinar números de copia de moléculas de cDNA.Nota: Vea la discusión para las cantidades esperadas. Enriquecimiento por captura de híbridos de ADN VIH-1.Nota: De este paso, es preferible utilizar tubos de microcentrífuga con propiedades de enlace de baja ácidos nucleicos así como puntas de pipeta de filtro aerosol para todas las muestras de ADN. Si es posible, trabajar en una estación de trabajo PCR. Todos los pasos y los reactivos están en RT (RT) a menos que se indique lo contrario. Para preparar una mezcla maestra de granos magnéticos estreptavidina, Pipetear 100 granos μl por muestra en un tubo de microcentrífuga sola. Coloque el tubo en un imán adecuado para tubos de microcentrífuga. Después de que los granos han colocado hacia el lado del imán del tubo (~ 1 min), sacar el buffer de almacenamiento, retire el tubo del imán y suspender granos en 500 μl de bind y lavado tampón (buffer BW, 5 mM Tris-HCL pH 7,5, EDTA 0,5 mM 1 M NaCl) para lavar. Coloque el tubo en imán, quite el sobrenadante y agregar 500 μl solución de caseína. Tomar del imán, resuspender e incubar por 10 min a temperatura ambiente, luego lavar con tampón de BW.Nota: Un lavado se refiere a colocar el tubo en el imán, sacar el sobrenadante, teniendo el tubo el imán, agregando el almacenador intermediario y resuspender. Coloque el tubo en el imán, sacar el sobrenadante y resuspender los granos en 500 μl de tampón de BW. Añadir 50 pmol de cada captura oligonucleótidos biotinilados (ver tabla 1, tres de oligos en este caso) por muestra. (Por ejemplo, si 5 muestras de ADN a procesar, utilizar 500 μl de granos magnéticos de paso 2.3.1 y 250 pmol de cada oligonucleótido). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente mientras que la oscilación en un mezclador de extremo a extremo. Lavar los granos con los oligonucleótidos inmovilizados dos veces con 500 μl de tampón diez de 1 x (10 mM Tris HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl). Resuspender los granos en 10 μl de 1 Tampón 10 x por muestra. Para cada muestra, etiquetar un tubo de microcentrífuga y añadir 10 μl de suspensión de perlas, 170 μl de ADN (del paso 2.1) y 90 μl de 3 x 10 buffer. Incubar en un bloque de calor seco a 92 ° C por 2 min desnaturalizar el ADN. Hacia los tubos de un bloque de calor seco diferentes, que se encuentra a 52 ° C, e incubar durante 1 h. invertir para mezclar regularmente (~ cada 10 minutos) durante la incubación. Una vez lavado con 500 μl de 1 x buffer diez y resuspender en 35 μl libre de nucleasa H2O. Para eluir, incubar los tubos a 92 ° C en un bloque de calor seco por 2 min. A continuación, mover rápidamente los tubos sobre el imán (un tubo a la vez). Una vez que los granos están limitados al lado del tubo, transferir el sobrenadante que contiene el ADN del VIH-1 a un tubo nuevo. Opcional: Repita qPCR (como hace en el paso 2.2.2) para determinar el cDNA del VIH-1 recuperado.Nota: Vea la discusión para las cantidades esperadas. 3. adaptador ligadura Preparando el adaptador Resuspender adaptador liofilizado (ver tabla 1 “completo Kwok + MiSeq”) a 100 μm en libre de nucleasa H2O. Por ejemplo más muestra un control, combinar 0.45 μl de 10 x buffer ligasa de T4 ADN, 4 μL de adaptador y 0.05 μl de H libre de nucleasas cada2O. calor a 92 ° C por 2 min y dejar enfriarán lentamente.Nota: Si la opción está disponible, use una máquina PCR con velocidad de enfriamiento ajustable (tasa de 2% de uso). Esto toma unos 30 min de 92 ° C a 16 ° C. Alternativamente, use un bloque de calor seco a 92 ° C y apagar. Saque el adaptador mastermix cuando el bloque de calor es volver a TA. Esto es dejar el adaptador forma una estructura de horquilla (ver figura 2b). Preparar una reacción de control con una serie de oligonucleótidos sintetizados (ver tabla 2) en lugar de ADN extraído de células. Realizar acciones de 100 μm de cada oligonucleótido. Mezclar 1 μl de cada uno de los 17 oligonucelotides y 8 μl de H2O para una relación equimolar en un volumen final de 25 μl. Diluir la mezcla 1:2,500 en libre de nucleasa H2O en una dilución seriada. 1 μl de la mezcla se combinan con 17.3 μl de H libre de nucleasa2O usar en la ligadura de la muestra de control en el paso 3.3.1 para que cada oligonucleótido está presente en el 1,6 fmol (equivalente a 0.026 nM en la reacción de 60 μL). Configuración de trompas Para reacciones de volumen final de 60 μL en tubos de PCR 6 μl de 10 x T4 ADN ligasa del almacenador intermediario, 24 μl de 40% PEG, 6 μl de 5 M betaína, μl 4.5 (400 pmol) de adaptador (pre-annelead como en el paso 3.1.2), 1,2 μl de T4 ADN ligasa (2.000.000 unidades/mL) y 18.3 μl de ADN (a partir de Paso 2.3.11)Nota: Tenga especial cuidado con soluciones viscosas como 40% PEG para mantener volúmenes exactos. No hacen un mastermix. Establecer la misma reacción ya que se realiza en el paso 3.3.1 pero con la mezcla de oligonucleótidos de control preparado en el paso 3.2.2. Mezclar bien las reacciones e incubar en una máquina PCR en 16 ° C durante la noche. 4. adaptador extracción y separación de tamaño Desnaturalizando electroforesis del gel Añadir 30 μl de formamida que contiene gel de ADN cargando buffer a cada reacción de ligadura. Mezclar por pipeteo. Calentar por 2 min a 94 ° C en la máquina de la polimerización en cadena y colocar inmediatamente en hielo. Coloque un prefabricado 6% borato/Tris/EDTA (TBE) desnaturalización urea gel de poliacrilamida (peine de 10 pozos) en un depósito de gel apropiado. Añadir 1 buffer de corriente x TBE (89 mM Tris base, el ácido bórico 89 mM, EDTA 2 mM) y funcionamiento previo el gel por 20 min en constante V/max 250. Lavar las bolsas de gel con el funcionamiento de búfer mediante una jeringa y una aguja de 21G. Carga cada 90 μl de la muestra en tres pocillos (30 μL por pocillo) y correr durante 20 min (250 V/max) hasta el frente del tinte azul oscuro es sobre a medio camino a través del gel. Tinción y cortar los ácidos nucleicos del gel Preparar 3 tubos de microcentrífuga pequeña (0.5 mL) por ejemplo empujando los agujeros en la parte inferior utilizando una aguja de jeringa de 21 G (tenga cuidado al trabajar con objetos punzantes). Introduzca cada uno de los tubos preparados en un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL y etiquetarlos con el nombre de la muestra más “bajo”, “mediados” o “high”. Sacar y abrir el cartucho de gel. Corte el gel verticalmente con una cuchilla de afeitar para generosamente la tira con 3 pozos de muestras cargados. Añadir la tira de gel a un recipiente con 1 x TBE (aproximadamente 30 mL) y 5 μl de tintura de Cianina ácidos nucleicos. Incubar durante 3-5 minutos.Nota: El paso de extracción de gel es particularmente sensible a la contaminación cruzada. Es recomendable ejecutar sólo 1 ejemplo por gel y utilizando un recipiente separado, limpio para cada tinción del gel. Guantes deben cambiarse si las partículas de gel en contacto con los dedos enguantados. Limpie la superficie de un transiluminador de luz azul con ddH2O. Tomar la pieza de gel en el recipiente de tinción y añadir a la caja de luz. Encender la caja de luz e inspeccione los ácidos nucleicos manchados a través del filtro naranja.Nota: El adaptador normalmente aparece sobrecargado y funciona como gran “blob” ligados ADN VIH-1 que como un rayo. Usando una hoja de afeitar nueva, corte los lados del gel si hay áreas con ninguna muestra cargado todavía presente. A continuación, corte apenas sobre el adaptador para quitar el adaptador y gel inferior partes. Finalmente, corte la parte superior del gel, incluyendo alrededor de 1 mm del gel de bolsillos, que a menudo tienen una señal intensa aguda de mayor peso molecular DNA. Dividir el pedazo restante de la gel que contiene la muestra, que es típicamente ~ 2 x 3 cm de tamaño, horizontalmente en tres trozos incluso: “baja”, “mid” y “alto” peso molecular.Nota: Cada pieza ahora se manejarán por separado [es decir., habrá tres tubos (bajo, medio y alto)] por la muestra original. Cada uno de los fragmentos de tres gel cortadas en trozos más pequeños (~ 2 x 2 partículas mm) y transferirlas a los tubos de microcentrífuga de preparado 0,5 mL (paso 4.2.1). Vuelta a la máxima velocidad con las tapas abiertas para 1 minuto exprimir las piezas de gel a través del orificio en el tubo de 2 mL para crear un gel de aguanieve. Si las partículas de gel permanecen en la parte inferior del tubo de 0.5 mL, transferir al tubo 2 mL manualmente usando una punta de aguja o pipeta. Extracción de ADN Añadir 1 mL de tampón de extracción de gel de urea (0,5 M NH4CH3CO2, 1 mM EDTA, 0.2% SDS) a los granizados de gel. Gire los tubos para un mínimo de 3 h (durante la noche es aceptable) a temperatura ambiente con una batidora de extremo a extremo. Utilizar un sistema limpio de pinzas para agregar un filtro de fibra de vidrio redondo a columnas de centrífuga con filtros de membrana de acetato de celulosa (0.2 μm), que evita la obstrucción de membrana. Coloque el filtro en su lugar con una punta de pipeta invertida. Brevemente girar los tubos de 2 mL con tampón de aguanieve y extracción de gel en una microcentrífuga y transferir 700 μl del sobrenadante a las columnas de filtro preparado. Mantenga el gel aguanieve y el sobrenadante restante. Centrifugue las columnas de filtro en una microcentrífuga a la máxima velocidad durante 1 minuto transferencia el flujo en un tubo nuevo de microcentrífuga de 2.0 mL. Volver a cargar las columnas con el sobrenadante restante. Trate de obtener tanto líquido como sea posible de la extracción del aguanieve. Transferencia de piezas de gel no es un motivo de preocupación. Vuelta otra vez y flowthroughs de las mismas muestras de extracción se combinan. Precipitación del ADN Agregar 3 μl de polyA RNA (1 μg/μl; como un portador), 1 μl de glucógeno y 0,7 mL de isopropanol para el flujo de paso 4.3.5. Mezclar brevemente y congelar a-80 ° C durante la noche. Tomar muestras del congelador de-80 ° C y dejarlos descongelar brevemente. Ponerlas en una microcentrífuga refrigerada (4 ° C) y vuelta por 30 min a velocidad máxima. Retire y descarte el sobrenadante. Ser muy cuidado de no remover el sedimento. Dejar 30 a 50 μl de líquido si es incierto ese diábolo se eliminaría en caso contrario.Nota: Por lo general todas las muestras de “altas” muestran un pellet más visible que las muestras de “mediadas” y “bajas”. Añadir 800 μl de etanol al 80%. Invierta los tubos y vuelta otra vez durante 1 min a velocidad máxima. Eliminar la mayoría del etanol con una pipeta, girar los tubos otra vez brevemente y quitar más etanol con una pipeta de volumen más pequeño. Que cualquier resto etanol se evaporan mediante la colocación de los tubos con una tapa abierta en un bloque de 55 ° C calor seco. Cuando las muestras están secas (2-4 minutos) Añadir 20 μl de libre de nucleasa H2O y la extensión alrededor de la parte inferior del tubo para asegurar el pellet de DNA se disuelve. La muestra de ADN puede ser almacenada a-20 ° C. 5. PCR amplificación y preparación de la biblioteca Una reacción de PCR 40 μl con 20 μl de ADN polimerasa pre-mezcla, 18 μL del precipitado y se redisuelve ADN de paso 4.4.5, 1 μl del primer avance “MP1.0 + 22HIV” (10) (ver tabla 1) y 1 μl de primers multiplex oligo (cartillas de índice 1 a 24) (véase mesa de Ma materiales).Nota: Ejecute que las tres reacciones (bajo, medio, alto) de cada muestra en reacciones de PCR independientes, pero con el mismo indexadas cartilla. Utilizar un índice diferente para cada una de las muestras de la infección original. Ejecutar las reacciones de PCR bajo las siguientes condiciones: desnaturalización de 94 ° C 2 min, luego 18 ciclos de PCR de 3 pasos; 15 s en desnaturalización de 94 ° C, 15 s de recocido a 55 ° C y extensión de s 30 a 68 ° C. Como una opción de control de calidad, analizar las reacciones de PCR con el sistema de electroforesis de gel de alta sensibilidad automatizada. Tomar 2 μl de una muestra de baja, media y alta para ejecutar según instrucciones del fabricante.Nota: Los dos cebadores deben ser visible y a menudo funcionamiento en una longitud calculada de sobre 45 y 95 nt (diferencia de longitud real). Además, se debe detectar ADN entre 150 a 500 nt. Si no hay señal, es aconsejable añadir ciclos adicionales de PCR, entre 2 y 10 ciclos adicionales. No añadir ciclos adicionales para las muestras de control de oligonucleótidos creados en el punto 3.3.2. Para quitar los iniciadores utilizan un sistema de limpieza basado en grano paramagnético PCR. Tomar 20 μl de cada reacción de PCR y piscina junto las muestras (mezclar todas las muestras en este punto). Congelar las reacciones de μl 20 restantes como copias de seguridad a-20 ° C. Deja las bolas paramagnéticas llegue a RT y las reacciones de PCR combinadas con 1,8 x el volumen de la solución de grano de la mezcla. Mezclar mediante pipeteo e incubar durante 5 minutos.Nota: Como ejemplo, si 4 muestras se prepararon y cada uno tiene reacciones bajas, media y altas, el volumen sería de 4 x 3 x 20 μl = reacciones de PCR de 240 μl con una solución de grano 432 μl. Poner los tubos en un imán de tubo de microcentrífuga, dejar que los granos se unen para ~ 1 min y sacar el sobrenadante para descartar. Dejar los tubos en el imán y agregar 500 μl de etanol al 80%. Deja el etanol por 30 s, luego despegar cuidadosamente y dejar que los granos seca al aire para ~ 5 min agregar 40 μl de H libre de nucleasa2O, los tubos fuera del imán y pipetear arriba y abajo varias veces. Dejar la suspensión durante 5 minutos poner el tubo en el imán, dejó las cuentas colocan al lado y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Esta es la biblioteca. Tomar 10 μl alícuota para controles de calidad y congelar el resto a-20 ° C. 6. evaluación de la biblioteca Determinar la calidad de la biblioteca, la concentración y la molaridad. Use un método de cuantificación fluorométrica. Medir 1 μl y 3 μl de la biblioteca con un kit de ensayo de dsDNA de alta sensibilidad según las instrucciones del fabricante.Nota: Concentraciones típicas están entre 1 y 10 ng/μl. Medida el espectro de peso molecular de ADN de biblioteca por alta sensibilidad automatizado de electroforesis en gel como se describió anteriormente (paso 5.2). Uso el gel análisis de la electroforesis para determinar el peso molecular promedio de la biblioteca y calcular para diluir la biblioteca libre de nucleasa H2O a 4 nM. Varias bibliotecas se pueden combinar como todos los índices son únicos. Control de calidad de bajo rendimiento opcional Perjuicio de la biblioteca de ADN TA19 de clonación para insertar las moléculas biblioteca en vectores para la amplificación. Siga las instrucciones del kit, crecen hacia fuera de ~ 10-20 colonias y extracto de ADN mediante miniprep protocolos, tal como se describe aquí20. Vector de secuencia usando los servicios locales de la secuencia y comprobar que los insertos contienen el VIH-1 deseado deriva secuencias y adaptadores específicos de biblioteca. 7. gestión de secuenciación de alto rendimiento de Crear una hoja de muestra de la secuencia con el software comercial con la plataforma de secuenciación. Indicar el juego de la secuencia seleccionada. Por lo general, elija un kit de 150 ciclos, pero otros son adecuados dependiendo de la longitud que desee leer. Seleccione “Sólo Fastq” como el flujo de trabajo de aplicación. Elija una de las plantillas que contiene los 24 índices presentes en el kit de multiplex de oligonucleótidos (indicado en el manual del kit). Seleccione “25 nt” para Read1 y “125 nt” de Read2. Mantener 6 nt índice solo leer.Nota: En el análisis interno Read2 sólo se utiliza en el análisis. Mantener Read1 a un mínimo de 25 nt para propósitos de plataforma algoritmo de secuenciación. Siga las instrucciones del fabricante, precisamente para la preparación de la biblioteca pre-funcionamiento y configuración. Optar por el máximo 20 pM concentración y uso una 15% PhiX espiga, como la biblioteca es de muy baja complejidad. 8. Análisis de datos Compruebe si el pass filtro porcentaje y puntaje de calidad de Q30 es aceptables según las instrucciones del fabricante de la plataforma de secuenciación.Nota: Filtro de paso suele ser > 90% y Q30 puntuaciones suelen ser > 80%. Descargar el. fastq.gz los archivos del centro de secuenciación del fabricante. Configurar la secuencia de comandos de la secuencia Crear un nuevo directorio (carpeta) llamado “AnalysisXYZ” y vaya a https://github.com/malimlab/seqparse para descargar los archivos de código fuente (parse_sam.pl, rc_extract.pl, parse.sh) en este directorio. Descargar el alineador de lectura corto Bowtie, versión 1.1.2, de http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml en el mismo directorio. La descarga crea un subdirectorio dentro de “AnalysisXYZ” llamado “Bowtie-1.1.2”. Dentro de este directorio subdirectorio “índices” de abrir y descargar las secuencias de plantilla provista de 6 archivos con extensiones .ebwt. Descargar las lecturas cortas FASTQ/A preproceso toolkit fastx-0.0.13 de http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html en el directorio “AnalysisXYZ”. Descargar Samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/) y bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) en el directorio “Documentos”. Mover el. fastq.gz archivos, descargados en el paso 8.2, de todo leen 2s (terminando en… _R2_001.fastq.gz) en el directorio “AnalysisXYZ”. Abra la consola/terminal de comandos. Hacia el “AnalysisXYZ” como el directorio actual mediante los comandos cd. Tipo “./parse.sh.” para ejecutar las secuencias de comandos. Encontrar los archivos .csv con resúmenes de todas las muestras en total leerlas cuentas, longitud ajustada Lee cuentas y normaliza cuentas leerlas, así como archivos con la variación de la base, para cada muestra en un directorio llamado parse_results dentro del directorio “Análisis XYZ”.Nota: Vea la discusión para más información sobre el proceso de análisis. La secuencia de comandos devuelve archivos csv con Lee total para cada nucleótido a lo largo de las secuencias de HIV-1NL4.3 fuerte parada y primer filamento transferencia hasta el nucleótido 635. Como una guía, Lee única de 50.000 a 100.000 típicamente se observa en muestras de infecciones con el número de celular indicado y el inóculo viral y sin proteínas antivirales o compuestos. La muestra de control de oligonucleótidos generalmente produce lecturas de 100.000 a 200.000.