決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

注: 特定の試薬とこのプロトコルで使用する機器、材料表を参照してください。 1. ウイルス産生と細胞への感染 注意: 感染の HIV-1 は、承認されたバイオ封じ込め実験室でのみ処理必要があります。 注: ヒト胚性腎 (HEK) 293 t 細胞、に従って 1.1 をステップ、標準的な手順し、されているのトランスフェクションによる HIV 1 粒子の生産15,16前述。一般的な細胞培養プロシージャは、17をは前述。 1 HIV ウイルス産生。 ダルベッコ 293 t 細胞変更 10% 牛胎児血清 (FBS) と 37 ° C、5% CO2 17を前述のように標準的な細胞文化のインキュベーターでペニシリン/ストレプトマイシン 1% (完全 DMEM) イーグル培 (DMEM) を維持します。 標準流ティッシュ文化フード成長媒体を削除し、293 t 細胞の合流付近 10 cm の細胞培養ディッシュ (~1.2 x 107セル) に予め温めておいた (37 ° C) のトリプシンの 3 mL を追加します。2-3 分のためのインキュベーターに皿を置きます。 ティッシュ文化フードに戻ってインキュベーターから料理を取る、7 mL の完全培地を追加します。ピペット、上下皿内で数回に細胞を再懸濁します。新しい 10 cm 皿に細胞懸濁液 2.5 mL を追加してセル 1:4 を分割し、7.5 ml の完全培地のそれを埋めます。 次の日、無血清最小必須培地 1 mL でプロウイルス HIV-1 プラスミド DNA (pNL4.3) などの 10 μ g を混合し、1 μ g DNA あたり 4.5 μ L でポリエチレンイミン (PEI) ソリューション (25,000 mW、1 mg/mL pH 7)。室温で 10 分間インキュベートし、293 t 細胞に滴下し追加します。 トランスフェクション後、24 h はメディアを取り出して、20 U/mL 中に RNase フリーの DNase を含む完全 DMEM の 6 mL を置き換えます。6 時間後、培地を完全 DMEM の 10 mL に置き換えます。 トランスフェクション後、48 h 上清を収穫し、15 mL ポリプロピレン チューブに 10 mL の注射器を使用して、0.22 μ m フィルターをフィルター処理します。 オープン トップ薄肉遠心チューブに 20% スクロースを滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 の 2 mL を追加します。ゆっくりとフィルター処理された細胞培養上清にショ糖をオーバーレイします。 4 ° c、超遠心機を使用しての 134,000 x g で 1 時間 15 分間遠心します。 超遠心機からチューブを慎重に取り外します。徐々 に清とショ糖の吸引またはピペットを使用して電源を取る。小さいピペットを使用し、最後のショ糖液を取り出し時にチューブを傾斜します。チューブの底に小球形にされたウイルスを残します。注: ペレットは表示されません。 1 × PBS を 200 μ l 添加、12 h 4 の冷蔵庫の中に残して、再懸濁します、-80 ° C で 20 μ L の因数でフリーズ P24ギャグコンテンツ使用を決定、p24 HIV 1 抗原検出 ELISA キット (次の製造元の指示)。 T 細胞ラインの感染症。 不死化 T 細胞株を培養 (e.g。、CEM SS セル) 10% FBS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (完全 RPMI) ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培で。1 ml の 2 × 106セル/ml、12 ウェル フォーマット細胞培養プレートで完全 RPMI 検定18と種子 1 サンプルあたりもを使用してセルをカウントします。 HIV-1 の粒子を追加 150 ng の p24 に相当ギャグと場所に揺れるプレート遠心分離機ベンチトップ遠心分離機 30 ° C で 2,000 x g で 2 時間の遠心分離でスピン感染する生物学的封じ込め蓋付きバケツ 遠心分離機からプレートを削除し、37 ° C、5% CO2で標準的な組織文化のインキュベーターで 1 時間休ませます。 入力ウイルスを洗い流すために細胞懸濁液を遠心管に転送して、2 分の 500 x g で RT (RT) で遠心機で遠心分離によって細胞を収集します。細胞ペレットを乱すことがなく上澄みを脱ぐ。 予め温めておいた (37 ° C)、1 mL の細胞ペレットを再懸濁します滅菌 1 × PBS。遠心、上清除去および再懸濁の手順を 2 回繰り返します。 再度遠心分離機、上澄みを除去し、完全 RPMI の 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。新しい 12 ウェル プレートの 1 つの井戸にそれぞれの懸濁液を追加します。 ウイルス (4 h 後遠心分離) の 6 h 後最初に加えでステップ 1.2.4 で遠心分離によってセルを収穫します。削除し、上澄みを廃棄します。細胞ペレットを-80 ° C で凍結または DNA の抽出のために直接処理することができます。 2. DNA 抽出、HIV 1 DNA の定量化、およびハイブリッド キャプチャで濃縮 ティッシュ文化セルのキット マニュアルに従うことによって、血液や組織総 DNA 抽出キットの全細胞の DNA を抽出します。唯一の変化は、ヌクレアーゼ フリー H の 200 μ L の溶出2O 提供溶出バッファーの代わりに。注: カオトロ ピック換散バッファー (キットの”アル”) とプロティナーゼの付加の後でサンプル バイオ セーフティ封じ込め実験室から削除できプロトコルの残りのための標準的な安全レベルの研究室で処理されます。 QPCR による HIV 1 cDNA のコピーの数を決定します。 ステップ 2.1 溶出の 17 μ L を取り出して DpnI 制限酵素の 1 μ L と 10 x 制限酵素バッファーの 2 μ L を追加します。任意の潜在的なの残留は、入力プラスミッド DNA をトランスフェクションから削除する 37 ° C で 1 時間インキュベートします。 次プライマー プローブ セットを使用してマイナス鎖強い停止 cdna qPCR 遂行: oHC64 (3 ‘5’-taactagggaacccactgc-) と oHC65 (3 ‘5’-gctagagattttccacactg-) と oHC66 をプローブ (5 ‘-ファム-acacaacagacgggcacacacta-タムラ-3 ‘)。qPCR セットアップと正確な条件は、参照6,13で見つけることが。CDNA 分子のコピー数を決定するための標準的な曲線として pNL4.3 プロウイルス プラスミドのシリアル希釈試料に沿って運ぶ。注: 予想される量のための議論を参照してください。 ハイブリッド キャプチャによって HIV 1 DNA 濃縮。注: このステップからそれはエアロゾル フィルター ピペット チップと同様、低核酸結合特性と全ての DNA サンプルのマイクロ遠心チューブ用を使うことが望ましい。可能であれば、PCR のワークステーションで作業します。すべてのステップと試薬は、特に明記しない限り、RT (RT) でです。 磁気ストレプトアビジン ビーズのマスター ミックスを準備するには、単一微量遠心チューブにサンプルあたり 100 μ L ビーズをピペットします。マイクロ遠心チューブ用に適した磁石にチューブを置きます。 ビーズは、チューブ (~ 1 分) の磁石側に落ち着いて後、ストレージ バッファーを脱いで、磁石からチューブを削除しバインドを 500 μ l 添加でビーズを再懸濁します、洗浄バッファー (BW バッファー、5 mM トリス塩酸 pH 7.5、0.5 mM EDTA、1 M 塩化ナトリウム) を洗浄します。 背面マグネット チューブを置き、上澄みを除去し、500 μ L カゼイン溶液を追加します。磁石を取る、再懸濁します、常温では、10 分間インキュベートし、BW バッファーで洗浄します。注意: 洗浄は、磁石にチューブを配置する、上澄みを取って、チューブを取って磁石、オフ、バッファーを追加して、再です。 背面磁石チューブを置き、上澄みを取る、BW バッファーを 500 μ l 添加のビードを再停止しなさい。サンプルあたり (この場合は表 1、3 oligos を参照) の各キャプチャのビオチン標識オリゴヌクレオチドの 50 pmol を追加します。(たとえば、5 の DNA のサンプルを処理する場合は、使用して 500 μ L 各オリゴヌクレオチドのステップ 2.3.1 と 250 pmol から磁気ビーズの)。 エンド オーバー エンド ミキサーでロッキングしながら室温で 30 分間インキュベートします。 1 x 10 バッファー (10 mM トリス塩酸 pH 8.0、1 ミリメートルの EDTA、100 mM の NaCl) の 500 μ L で 2 回固定化オリゴヌクレオチドとビーズを洗浄します。 10 μ L のサンプルあたり 1 x 10 バッファーのビードを再懸濁します。 各サンプルのラベル 1 つ遠心チューブ、ビーズ懸濁液の 10 μ L、170 μ L の DNA の追加 (手順 2.1) から、3 x 10 のバッファーの 90 μ L。DNA を変性する 2 分 92 ° C で乾燥した熱ブロックで孵化させなさい。 52 ° C に設定すると、別の乾熱ブロックにチューブを移動し、1 h. 定期的にミックスする反転インキュベート (~ 10 分毎) この潜伏中。 500 μ L x 10 のバッファー 1 ので 1 回洗浄し、ヌクレアーゼ フリー 35 μ L で再懸濁します H2o. 溶出が、92 ° c を 2 分間の乾熱ブロックでチューブをインキュベートします。マグネット (一度に 1 つの管) にチューブをすばやく移動します。チューブの側面にビーズをバインドすると、新鮮なチューブに HIV 1 DNA を含む上清を転送します。 オプション: 繰り返して qPCR (2.2.2 のステップで実行) 回復の HIV-1 cDNA を決定します。注: 予想される量のための議論を参照してください。 3. アダプター結紮 アダプターを準備します。 凍結乾燥のアダプターを再懸濁します (表 1 「完全國 + MiSeq」参照) ヌクレアーゼ フリー H で 100 μ m で2o. サンプル、コントロールは 1 つのサンプルあたり 0.45 μ L を組み合わせて T4 DNA リガーゼ バッファー、アダプターの 4 μ L および H のヌクレアーゼ フリーの 0.05 μ L x 10 の22 分の 92 ° c o. 熱せの各クールダウンゆっくり。注: オプションが利用可能な場合は、調節可能な冷却率 (使用率 2%) と PCR 機械を使用します。これは 92 ° C から 16 ° C に約 30 分かかりますまた、92 ° C で乾燥した熱ブロックを使用しをオフにします。熱ブロックは右に戻るときアダプター マスター ミックスを取り出すこれはアダプターのヘアピン構造を形成させる (図 2bを参照)。 一連の細胞から抽出した DNA の代わりに合成オリゴヌクレオチド (表 2参照) と制御反応を準備します。 各オリゴヌクレオチドの 100 μ M の在庫を確認します。17 oligonucelotides のそれぞれの 1 μ L を混合し、25 μ L の最終巻で H2O のモル比の 8 μ L を追加します。 ヌクレアーゼ フリー H でミックス 1:2,500 を希釈2O シリアル希釈で。ヌクレアーゼ フリー h 17.3 μ L とミックスの 1 μ L を組み合わせて各オリゴヌクレオチドは 1.6 fmol であるのでステップ 3.3.1 でコントロール サンプル結紮に使用する2O (0.026 に相当 60 μ L 反応 nM)。 を設定 PCR チューブに 60 μ L 最終巻反応結合 T4 DNA リガーゼ x 10 の 6 μ L のバッファー、40% の 24 μ L ペグ、5 M のベタイン、4.5 μ (400 pmol) アダプター (前 annelead ステップ 3.1.2 のように)、6 μ T4 DNA リガーゼ (2,000,000 単位/mL) の 1.2 μ L、(からの DNA の 18.3 μ L2.3.11 のステップ)注: 粘性溶液の 40% など特別な注意を取る量を正確に維持するためにペグ。マスター ミックスをしないようにします。 3.3.1 のステップが準備した 3.2.2 制御オリゴヌクレオチド ミックスを実行、同じ反応を設定します。 反応をよく混ぜ、一晩 16 ° C で PCR 機で孵化させなさい。 4. アダプターの取り外しとサイズ分離 ゲルの電気泳動の変化 それぞれの ligation の反作用にローディングバッファー ホルムアミドを含む DNA ゲルの 30 μ L を追加します。ピペッティングでよく混ぜます。 PCR マシンで 94 ° C で 2 分加熱し、すぐに氷の上に置きます。 適切なゲル タンクにプレキャスト 6% トリス/ホウ酸/EDTA (TBE) 変化尿素ポリアクリルアミドのゲル (10 よく櫛) を配置します。1 x TBE (89 mM 89 mM ホウ酸トリス ベース 2 ミリメートルの EDTA) 連続したバッファーを追加し、前 250 V/最大定数で 20 分のためのゲルを実行します。 21 G 針とシリンジを使用してバッファーを実行するとゲルのポケットを洗い流します。 負荷 20 分 (250 V/最大) 濃い青色色素前面まで 3 つの井戸 (30 μ L/ウェル) に各 90 μ L のサンプルはゲルを通って途中でです。 染色・加工核酸ゲルから 21 G 注射針 (注射針などでの作業中を取る注意) を使用して下部に穴を突っついて、サンプルあたり 3 小さなマイクロ遠心チューブ用 (0.5 mL) を準備します。準備されたチューブ 2.0 mL 遠心チューブに挿入し、「ミッド」または「高」サンプル名に加えて、「低」のラベルを付けます。 取り出して、ゲル カセットをこじ開けます。惜しみなくロードされたサンプルの 3 の井戸とストリップを消費税にかみそりの刃と垂直方向にゲルをカットします。1 x TBE (約 30 mL) とシアニン核酸染色の 5 μ L の容器にゲルのストリップを追加します。3-5 分間インキュベートします。注: ゲル抽出手順は、交差汚染に特に敏感です。ゲルおよび各ゲルの汚損のため独立したきれいなコンテナーの使用につき 1 サンプルをのみ実行することをお勧めします。ゲル粒子が手袋をはめた指を連絡する場合、手袋を変更必要があります。 DdH2o. で徹底的に青い光の transilluminator の表面をきれいに染色容器からゲル部分を取り、それをライト ボックスに追加します。 ライト ボックスをオンにし、オレンジ色のフィルターを通してステンド グラスの核酸を検査します。注: アダプターは、通常オーバー ロードされた表示され、連勝として実行する結紮の HIV-1 の DNA と大きな”blob”として実行されます。 ないサンプルの区域がある場合は、ゲルの側面を切り取る新しいかみそりの刃を使用して今も読み込まれます。次に、アダプターを削除して、ゲルの部分の下にアダプター上だけカットします。最後に、切り取るゲルなどの最上部約 1 mm のゲルのポケットには、しばしば高分子量 DNA の鋭い強烈な信号があります。 サンプルでは、これは通常 2 〜 3 倍を含む残りのゲル部分を分割 cm 三個でも水平方向にサイズ:「低」、「中」、「高」分子量領域。注: 各部分は今は個別に処理 [i.e。、(低、中、および高) 3 つの管がある] 元のサンプルあたり。 小さな断片 (~ 2 × 2 mm 粒子) にそれぞれの 3 つのゲル断片をカットし、準備中の 0.5 mL 遠心チューブ (ステップ 4.2.1) にそれらを転送します。 ゲルの秘密を作成する 2 mL チューブに穴をゲル部分を絞る 1 分のオープン蓋をトップ スピードでスピンします。任意のゲル粒子が 0.5 mL チューブの底に残っている場合は、針またはピペットの先端を使用して手動で 2 mL チューブに転送できます。 DNA の抽出 ゲル スラッシュに尿素ゲル抽出バッファー (0.5 M NH4CH3CO2、1 ミリメートルの EDTA、0.2 %sds) の 1 つの mL を追加します。3 h 以上のチューブを回転 (一晩は許容) エンド オーバー エンド ミキサー常温。 セルロース アセテート膜フィルター (0.2 μ m)、膜の目詰まりを避けると遠心分離機の列に 1 つの小さな丸いガラス繊維フィルターを追加するのにピンセットのきれいなセットを使用します。倒立ピペット先端のある場所でフィルターをかけます。 簡単に遠心機にゲルの秘密と抽出を 2 mL 管をスピンし、上澄みの 700 μ L を準備されたフィルター列に転送します。ゲルの秘密と残りの上清を維持します。 1 分新しい 2.0 mL 遠心チューブに転送、透水のトップ スピードでの遠心フィルター列を遠心します。 残りの上清を持つ列を再読み込みします。秘密の抽出からできるだけ多くの液体としてを取得しようとします。ゲル部分の転送は、重要ではないです。再びスピンし、同じ抽出サンプルの flowthroughs を組み合わせます。 DNA の沈殿物 ポリア RNA の 3 μ L を追加 (1 μ g/μ L; キャリアとして)、グリコーゲンと 4.3.5 のステップから、吸収にイソプロパノール 0.7 mL の 1 μ L。簡単に渦と一晩-80 ° C で凍結。 -80 ° C のフリーザーのサンプルを取るし、簡単に解凍させます。冷却 (4 ° C) 遠心と最高速で 30 分のスピンに入れてください。 削除し、上澄みを廃棄します。ペレットを削除しないように非常に注意します。そのペレットがそれ以外の場合削除されるが不明である場合は、液体の 30 に 50 μ L をままにします。注: 通常すべての「高」のサンプル表示「ミッド」、「低」のサンプルよりももっと目に見えるペレットです。 80% エタノールの 800 μ L を追加します。チューブとトップ スピードで 1 分にもう一度スピンを反転します。ピペットとエタノールの大半を削除、簡単にチューブをもう一度、スピンし、小さいボリューム ピペットとより多くのエタノールを削除します。 55 ° C の乾燥した熱ブロックに開くふた付きチューブを配置することによって蒸発させる残りのエタノールができます。サンプルのドライ (2 〜 4 分) 追加 20 μ L ヌクレアーゼ フリー h2O および DNA の餌を確保するためチューブの下部全体に広がりましたが解散したとき。DNA サンプルは-20 ° C で保存できます。 5. PCR 増幅とライブラリの準備 DNA ポリメラーゼ プレミックスの 20 μ L で 40 μ L の PCR 反応を設定、18 μ L の沈殿し、ステップ 4.4.5、前方のプライマー「MP1.0 + 22HIV」の 1 μ l から DNA を再溶解 (10 μ m) (表 1を参照)、および多重オリゴ プライマー (インデックス プライマー 1 に 24) の 1 μ l ( Ma の表を参照丈)。注: 3 つの反作用 (低中、高) が同じ別の PCR の反作用で各サンプルのプライマーをインデックス付けを実行します。元の感染サンプルの各別のインデックスを使用します。 以下の条件で PCR の反作用を実行: 変性 94 ° C で 2 分し、3 ステップ pcr 法の 18 サイクル15 秒 94 ° C の変性、15 s は、55 ° C、および 68 の ° C で 30 s 拡張子の焼鈍 品質管理オプションとして自動高感度ゲル電気泳動システム、PCR 反応を分析します。2 μ L の製造元の指示に従ってを実行する低・中・高のサンプルを取る。注: 2 つのプライマーは、表示され、多くの場合 (実際の長さとは異なります) 45 と 95 nt についての計算された長さで実行する必要があります。150 に 500 の間 DNA を検出必要がありますさらに、nt。信号が存在しない場合は、追加の 2 と 10 のサイクルの間、追加の PCR のサイクルを追加することをお勧めします。3.3.2 の手順で作成したオリゴヌクレオチド コントロール サンプルの追加サイクルを追加しないでください。 削除プライマーは常磁性ビーズを用いた PCR クリーン アップ システムを使用します。 各 PCR 反応 20 μ L を取り、(この時点ですべてのサンプルをミックス) 一緒にサンプルをプールします。-20 ° C でバックアップとして残りの 20 μ L 反応を凍結します。 RT に来て、ミックス ビーズ溶液の量 x 1.8 プールされた PCR の反作用の常磁性ビーズをしましょう。ピペッティングで混ぜるし、5 分間インキュベートします。注: 例、4 サンプルが準備された場合、それぞれ低・中・高の反応がある、ボリュームになる 20 μ L x 3 x 4 = 432 μ L ビーズ ソリューションと 240 μ L PCR の反作用。 遠心チューブ マグネットにチューブを入れて、ビーズ 〜 1 分、バインドし、離陸、上清を破棄します。磁石をチューブのまま、80% エタノール 500 μ L を追加します。 30 のエタノールのまま s、徹底的に離陸し、ヌクレアーゼ フリー h ~ 5 分追加 40 μ L のビーズ センサー2O、磁石からチューブを取るし、上下に複数回ピペットします。 磁石に戻って 5 分入れて懸濁液管を残して、ビーズ側に解決し、上清を新しいチューブに転送。これは、ライブラリです。10 μ L 分注精度管理用と-20 ° C で残りの部分を凍結 6. ライブラリの評価 ライブラリの品質、濃度、モル濃度を決定します。 蛍光定量法を使用します。1 μ L と製造元の指示に従って高感度 dsDNA アッセイ キットとライブラリの 3 μ L を測定します。注: 一般的な濃度は 1 〜 10 ng/μ L の間です。 測定高感度によってライブラリ DNA 分子スペクトルは、(ステップ 5.2) 上記のようにゲル電気泳動を自動化しました。 自動化されたゲルの電気泳動解析ライブラリの平均分子量を決定するため、ヌクレアーゼ フリー H でライブラリを希釈する計算使用2O 4 nM。すべてのインデックスが一意である限り、いくつかのライブラリを結合できます。 省略可能なスループットの品質管理 増幅のためのベクトルにライブラリ分子を挿入する TA クローニング19の DNA ライブラリを対象します。キットの指示に従って、10 〜 20 を成長のコロニーそして抽出 DNAを介してminiprep のプロトコル、20をここで説明。 サービスをローカル配列と挿入を含む目的の HIV-1 シーケンス ベクトルの派生シーケンスおよびライブラリ固有のアダプター。 7. 高スループット シーケンス実行 シーケンスのプラットフォームが提供する商用ソフトウェアにシーケンスのサンプル シートを作成します。 選択したシーケンス キットを示します。通常、150 サイクル キットを選択、他は必要な読み取り距離に応じて適切なです。 アプリケーション ワークフローとして「Fastq のみ」を選択します。(キット マニュアルに示される) 多重オリゴヌクレオチド キットに 24 のインデックスを格納するテンプレートのいずれかを選択します。 選択”25 nt」Read1 の「125 nt”Read2 の。単一インデックスを読むにしてください 6 nt。注: 自社分析 Read2 のみが分析で使用されています。少なくとも 25 の Read1 を保つ nt プラットフォーム アルゴリズム目的のシーケンス処理。 実行前のライブラリの準備とセットアップについて正確に製造元の指示に従ってください。最大 20 を選ぶ pM 濃度と非常に低い複雑さはライブラリとして 15 %phix スパイク使用。 8. データ分析 パス フィルターの割合と平均 Q30 品質スコアがシーケンス処理プラットフォーム製造元のガイドラインに従って許容されるを確認します。注: フィルターは通常 > 90%、Q30 スコアは > 80% で、通常。 ダウンロードします。 fastq.gz ファイルを製造元のシーケンス ハブから。 シーケンス スクリプトの設定 “AnalysisXYZ”をという名前の新しいディレクトリ (フォルダー) を作成し、このディレクトリにすべてのソース コード ファイル (parse_sam.pl、rc_extract.pl、parse.sh) をダウンロードする https://github.com/malimlab/seqparse に移動します。 同じディレクトリに http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml から短鎖リード アライナ、ボウタイ、バージョン 1.1.2 をダウンロードしてください。 ダウンロードは、”AnalysisXYZ”「ボウタイ 1.1.2″をという名前サブディレクトリを作成します。このディレクトリ内にあるサブディレクトリ「インデックス」を開き、.ebwt 拡張子を持つ六つのファイルから成る提供されるテンプレート配列をダウンロードします。 処理前の”AnalysisXYZ”ディレクトリにツールキット fastx – http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html から 0.0.13 FASTQ/A 短いリードをダウンロードします。 「ドキュメント」ディレクトリに Samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/) と bam readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) をダウンロードします。 移動します。 すべての 8.2、手順でダウンロードした fastq.gz ファイルは”AnalysisXYZ”ディレクトリに期… _R2_001.fastq.gz 2 s を読みます。 コマンド コンソール/ターミナルを開きます。Cd コマンドを使用して現在のディレクトリとして”AnalysisXYZ”に移動します。スクリプトを実行する”./parse.sh”の種類。 合計読み取り数のすべてのサンプルの概要を含む .csv ファイルを見つける、長さが調整数を読み取りと読み取り数を正規化し同様”分析 XYZ”ディレクトリ内の parse_results という名前のディレクトリで各サンプルに対して、基本バリエーションを持つファイルします。注: 分析プロセスについてのディスカッションを参照してください。スクリプトは、ヌクレオチド 635 までとは、HIV-1NL4.3強力な停止シーケンスと鎖の最初の転送に沿って各ヌクレオチドのため合計読み取り csv ファイルを返します。、ガイダンスとして、50,000、100,000 のユニークな読み取りは通常示された細胞数, ウイルス接種と抗ウイルスのタンパク質や化合物なしの感染症からのサンプルにおいてください。オリゴヌクレオチド コントロールのサンプルは通常 100,000、200,000 の読み取りを生成します。