Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Opmerking: Raadpleeg de Tabel van de materialen voor specifieke reagentia en apparatuur die in dit protocol wordt gebruikt. 1. virus productie en cel infectie Let op: De besmettelijke HIV-1 moet alleen op goedgekeurde bioveiligheid insluiting laboratoria worden behandeld. Opmerking: Productie van HIV-1 deeltjes door voorbijgaande transfectie van menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen, zoals beschreven in stap 1.1, is een standaardprocedure en is eerder beschreven15,16. Eerder beschreven algemene celkweek procedures zijn17. HIV-1 virus productie. Handhaven 293T cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine (volledige DMEM) in een standaard cel cultuur incubator bij 37 ° C en 5% CO2 zoals eerder beschreven17. In een standaard laminaire flow weefselkweek kap Verwijder het medium van de groei en voeg 3 mL trypsine voorverwarmde (37 ° C) aan een in de buurt van-heuvels 10 cm cel cultuur schotel (~1.2 x 107 cellen) van 293T cellen. Zet de schotel terug in de incubator voor 2-3 min. Rekening de schotel uit de incubator terug de weefselkweek kap en voeg 7 mL van volledige medium. Pipetteer op en neer binnen het Gerecht meerdere malen naar resuspendeer de cellen. Splitsen van de cellen 1:4 door 2,5 mL van de celsuspensie toe te voegen aan een nieuwe 10 cm schotel en vul deze met 7,5 mL volledige voedingsbodem. De volgende dag, meng 10 µg proviraal HIV-1 plasmide DNA (zoals pNL4.3) met 1 mL serumvrij minimaal essentiële medium en voeg polyethylenimine (PEI) oplossing (25.000 mW, 1 mg/mL pH 7) aan 4.5 µL per 1 µg DNA. Incubeer gedurende 10 min op RT en ontkleuring toe te voegen aan de cellen van de 293T. 24u na transfectie, het medium verwijderen en te vervangen door 6 mL van volledige DMEM met RNase-vrije DNase op 20 U/mL medium. Na 6 uur, door het medium te vervangen door 10 mL van volledige DMEM. 48 uur na de transfectie, oogst het supernatant en filtreer het door een 0,22 µm filter, met behulp van een 10 mL spuit, in een polypropyleen tube van 15 mL. Voeg 2 mL steriele 20 gewichtspercenten sacharose in 1 x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan een open-top dunwandige ultracentrifuge buis. Langzaam bedekken de sacharose met de gefilterde cel bezinken. Centrifugeer gedurende 1 h 15 min bij 134.000 x g bij 4 ° C met behulp van een ultracentrifuge. Verwijder zorgvuldig de buizen van de ultracentrifuge. Langzaam opstijgen naar zowel de bovendrijvende substantie als sacharose met behulp van het een zuiging of een pipet. Gebruik een kleinere pipet en kantelen van de buis bij het nemen van de laatste sacharoseoplossing uit. Laat het Ingehuld virus in de onderkant van de buis.Opmerking: De pellet zal niet zichtbaar zijn. Voeg 200 µL van 1 x PBS, laat in de koelkast voor 4 tot 12 h resuspendeer en bevriezen in 20 µL aliquots bij-80 ° C. Bepalen p24Gag inhoud gebruikt het een p24 HIV-1 antigeen ELISA kit (volgende fabrikant instructies). T-cel lijn infectie. Cultuur een vereeuwigd T-cel-lijn (bv., CEM-SS cellen) in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine (volledige RPMI). Met behulp van een hemocytometer18 en zaad 1 goed per monster met 1 mL van de volledige RPMI met 2 x 106 cellen/mL in een 12-well formaat plaat voor de cultuur van de cel cellen te tellen. Toevoegen van HIV-1 deeltjes gelijk aan 150 ng p24Gag en plaats de plaat in een swingende Centrifugeer emmer met biocontainment deksels te draai-infecteren door centrifugeren in een benchtop centrifuge voor 2 h bij 2.000 x g bij 30 ° C. Verwijder plaat uit de centrifuge en laat het rusten gedurende 1 uur in een standaard weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Verzamelen om te wassen input virus af, cellen door overdracht van de cel schorsingen microcentrifuge buizen en centrifugeren in een microcentrifuge op RT (RT) bij 500 x g gedurende 2 min. Opstijgen het supernatant zonder verstoring van de cel-pellet. Resuspendeer de cel pellets in voorverwarmde (37 ° C), 1 mL steriele 1 x PBS. Herhaal het centrifugeren, supernatant verwijdering en resuspensie stappen twee meer tijden. Centrifugeer nogmaals, verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pellets in 1 mL van volledige RPMI. Voeg elke schorsing aan één putje in een nieuwe 12 goed plaat. Oogsten in 6 uur na eerste toevoeging van virus (4 h na centrifugeren), de cellen op door middel van centrifugeren, zoals gedaan in stap 1.2.4. Verwijderen en verwijder het supernatant. De cel pellets kunnen worden bevroren bij-80 ° C of verwerkt rechtstreeks voor DNA-extractie. 2. DNA-extractie, HIV-1 DNA kwantificering en verrijking door hybride vastleggen Pak de hele cel DNA met een bloed en weefsel totale DNA extractie kit door het volgen van de handleiding van de kit voor weefselkweek cellen. De enige wijziging is elutie in 200 µL van nuclease-vrije H2O in plaats van de meegeleverde elutie buffer.Opmerking: Na toevoeging van de chaotropic lysis-buffermengsel (de kit “AL buffer”) en de proteïnase, monsters kunnen worden verwijderd uit het laboratorium van de insluiting bioveiligheid en verwerkt in een laboratorium standaard veiligheid niveau voor de rest van het protocol. Het bepalen van het exemplaaraantal van HIV-1 cDNA door qPCR. Neem 17 µL van het eluaat uit stap 2.1 en voeg 2 µL van 10 x restrictie-enzym buffer samen met 1 µL van het restrictie-enzym DpnI. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C om alle potentiële residuele input plasmide DNA van transfectie. Uitvoeren van qPCR voor min fronten sterk-stop cDNA met behulp van de volgende primer sonde set: oHC64 (5 ‘-taactagggaacccactgc-3) en oHC65 (5 ‘-gctagagattttccacactg-3) en sonde oHC66 (5 ‘-FAM-acacaacagacgggcacacacta-TAMRA-3 ‘). qPCR setup en exacte voorwaarden kunnen worden gevonden in de referenties6,13. Voorhebben over monsters met een seriële verdunning van pNL4.3 proviraal plasmide als een standaard curve te bepalen van moleculen van cDNA moleculen.Opmerking: Zie bespreking voor verwachte hoeveelheden. HIV-1 DNA verrijking door hybride vastleggen.Opmerking: Vanuit deze stap voorwaarts is het beter om het gebruik van microcentrifuge buizen met lage nucleïnezuur bindende eigenschappen evenals aërosol filter Pipetteer tips voor alle DNA-monsters. Indien mogelijk, werken in een PCR-workstation. Alle stappen en reagentia zijn op RT (RT), tenzij anders vermeld. Pipetteer 100 µL kralen per monster in de buis van een enkele microcentrifuge ter voorbereiding van een master mix van magnetische daar kralen. Plaats de buis op een magneet geschikt voor buizen van de microcentrifuge. Nadat de kralen hebben geregeld naar de zijde van de magneet van de buis (~ 1 min), opstijgen van de opslag-buffer, verwijderen van de buis van de magneet en resuspendeer kralen in 500 µL van bind en buffer (BW buffer, 5 mM Tris-HCL pH 7.5, 0.5 mM EDTA wassen 1 M NaCl) te wassen. Plaats de buis terug op magneet, verwijder het supernatant en voeg van 500 µL caseïne oplossing. Neem van de magneet, resuspendeer en incubeer gedurende 10 min op de RT, dan wassen met BW buffer.Opmerking: Een wassen verwijst naar de plaatsen van de buis aan de magneet, opstijgen het supernatant, nemen de buis uit de magneet, het toevoegen van de buffer en resuspending. Plaats buis terug op de magneet, opstijgen het supernatant en resuspendeer kralen in 500 µL van BW buffer. Voeg 50 pmol van elke vastleggen biotinyleerd oligonucleotides (Zie tabel 1, drie oligos in dit geval) per monster. (Bijvoorbeeld als 5 DNA-monsters worden verwerkt moeten, gebruiken 500 µL van magnetische kralen uit stap 2.3.1 en 250 pmol van elke oligonucleotide). Incubeer gedurende 30 min op RT terwijl het schommelen in een eind over mixer. Kralen met de geïmmobiliseerdet oligonucleotides tweemaal met 500 µL van 1 x tien buffer (10 mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) wassen. Resuspendeer kralen in 10 µL van 1 x tien buffer per monster. Voor elk monster label een microcentrifuge buis en 10 µL van kralen schorsing, 170 µL van DNA toe te voegen (uit stap 2.1) en 90 µL van 3 x tien buffer. Bebroed in een blok van de droge hitte op 92 ° C gedurende 2 minuten te denatureren van het DNA. De buisjes naar een blok van verschillende droge hitte, die is ingesteld op 52 ° C, en incubeer gedurende 1 h. omkeren te mengen regelmatig (~ elke 10 min) tijdens deze incubatie. Een keer wassen met 500 µL 1 x tien buffer en resuspendeer in 35 µL nuclease-vrije H2O. Incubeer de buizen op 92 ° C in een blok van de droge hitte gedurende 2 minuten om te elueren. Vervolgens verplaatst snel de buizen op de magneet (één buis tegelijk). Zodra kralen zijn gebonden aan de kant van de buis, breng het supernatant met het DNA van HIV-1 aan een verse buis. Optioneel: Herhaal qPCR (zoals gedaan in stap 2.2.2) om te bepalen van de herstelde cDNA van HIV-1.Opmerking: Zie bespreking voor verwachte hoeveelheden. 3. adapter afbinding Voorbereiding van de adapter Resuspendeer gelyofiliseerd adapter (Zie tabel 1 “volledige Kwok + MiSeq”) op 100 µM in nuclease-vrije H2O. Per monster plus één controlemonster, combineren 0,45 µL van 10 x T4 DNA ligase buffer 4 µL van adapter en 0,05 µL van nuclease-vrije H2O. warmte tot 92 ° C gedurende 2 minuten en laat elke afkoelen langzaam.Opmerking: Als de optie beschikbaar is gebruik een PCR-machine met verstelbare koeling tarief (gebruik 2%-tarief). Dit duurt ongeveer 30 min van 92 ° C tot 16 ° C. U kunt ook gebruik van een blok van droge hitte op 92 ° C en uitschakelen. Neem de adapter mastermix uit wanneer de warmte blok terug op RT. is Dit is om te laten de adapter vormen een haarspeld-structuur (Zie Figuur 2b). Voorbereiding van een reactie van de controle met een set van samengestelde oligonucleotides (Zie tabel 2) in plaats van DNA geëxtraheerd uit cellen. Voorraden 100 µM van elke oligonucleotide maken Meng 1 µL van elk van de 17 oligonucelotides en 8 µL van H2O voor een mengsel verhouding in een eindvolume van 25 µL toevoegen. Verdun de mix 1:2,500 in nuclease-vrije H2O in een seriële verdunning. Combineer 1 µL van het mengsel met 17.3 µL van nuclease-gratis H2O om te gebruiken in de controle monster afbinding in stap 3.3.1 zodat elke oligonucleotide aanwezig op 1.6 fmol is (gelijk aan 0.026 nM in de 60 µL reactie). Ligations instellen Voor 60 µL eindvolume reacties in PCR buizen combineren 6 µL van 10 x T4 DNA ligase buffer, 24 µL van 40% PEG, 6 µL van 5 M betaïne, 4.5 µL (400 pmol) van adapter (pre-annelead zoals in stap 3.1.2), 1.2 µL van T4 DNA ligase (2.000.000 eenheden/mL) en 18.3 µL van DNA (vanaf stap 2.3.11)Opmerking: Wees extra voorzichtig met visceuze oplossingen zoals 40% PEG om nauwkeurige volumes. Maak niet een mastermix. Dezelfde reactie als uitgevoerd in stap 3.3.1 maar met het besturingselement oligonucleotide mix, bereid in stap 3.2.2 ingesteld. Meng de reacties goed en na een nacht bebroeden in een PCR machine bij 16 ° C. 4. adapter verwijderen en grootte scheiding Denaturering van de Elektroforese van het gel Voeg 30 µL van formamide-bevattende DNA-gel laden van de buffer met elke afbinding-reactie. Meng goed door pipetteren. Warmte voor 2 min bij 94 ° C in PCR machine, onmiddellijk zet dan op ijs. Plaats een geprefabriceerd 6% Tris/boraat/EDTA (FSME) denatureren ureum polyacrylamidegel (10-well kam) in een passende gel-tank. Toevoegen van 1 x TBE (89 mM Tris-base, boorzuur 89 mM, 2 mM EDTA) lopende buffer en vooraf uitvoeren de gel voor 20 min op 250 V/max-constante. De gel zakken met het runnen van de buffer met behulp van een spuit en naald 21G wassen. Belasting elk 90 µL monster in drie putten (30 µL per putje) en run voor 20 min (250 V/max) tot de voorkant van de donkerblauwe kleurstof ongeveer halverwege door het gel is. Kleuring en snijden nucleïnezuren uit de gel Bereiden 3 kleine microcentrifuge buizen (0,5 mL) per monster door prikken gaten in de bodem met behulp van een naald spuit 21 G (Neem voorzichtigheid tijdens het werken met slijpsel). Elk van de bereid buizen in een tube van 2,0 mL microcentrifuge invoegen en hen label met de naam van het monster plus “laag”, “Midden” of “hoog”. Neem en loeren open de gel-cassette. Snijd de gel verticaal met een scheermesje royaal accijnzen de strip met de 3 putten van geladen monsters. De gel-strip toevoegen aan een container met 1 x FSME (ongeveer 30 mL) en 5 µL van cyanine nucleïnezuur vlek. Incubeer gedurende 3-5 min.Opmerking: De gel extractie stap is bijzonder gevoelig voor kruisbesmetting. Het is raadzaam om alleen 1 monster per gel en het gebruik van een aparte, schone container voor elke gel kleuring worden uitgevoerd. Handschoenen moeten worden gewijzigd als gel deeltjes contact met gehandschoende vingers. Reinigen van het oppervlak van een blauwe lichte transilluminator grondig met ddH2O. De gel-stuk uit de kleuring container nemen en toe te voegen aan de lichtbak. Zet de lichtbak en inspecteren van de gekleurde nucleic zuren door de oranje filter.Opmerking: De adapter meestal verschijnt overbelast en grote “blob” met ligaturen HIV-1 DNA waarop hoger wordt uitgevoerd als een streep worden uitgevoerd. Met behulp van een nieuwe scheermes, knippen weg de zijkanten van de gel als er gebieden met geen enkel monster geladen nog steeds aanwezig. Vervolgens snijd net boven de adapter aan op de adapter verwijderen en lager gel delen. Ten slotte weggesneden helemaal boven aan de gel, met inbegrip van ongeveer 1 mm van de gel zakken, die vaak een scherpe intens signaal van hoger molecuulgewicht DNA hebben. Verdeel de resterende gel stuk met het monster, die meestal ~ 2 x 3 is cm groot, horizontaal in drie zelfs stukjes: “laag”, “Midden” en “hoog” molecuulgewicht gebieden.Opmerking: Elk stuk zal nu afzonderlijk worden behandeld [dwz., zal er drie buizen (laag, mid en hoog)] per oorspronkelijke monster. Snijd elk van de drie gel fragmenten in kleinere stukken (~ 2 x 2 mm deeltjes) en ze vervolgens overbrengen naar de geprepareerde 0,5 mL microcentrifuge buizen (stap 4.2.1). Spin op topsnelheid met open deksels voor 1 min te knijpen de gel stukken door het gat in de buis 2 mL maken een slush gel. Als elk gel deeltjes in de onderkant van de buis van 0,5 mL blijven, kunt u deze overbrengen naar de 2 mL-buis handmatig met behulp van een naald of pipette uiteinde. DNA-extractie 1 mL van ureum gel extractie buffer (0.5 M NH4CH3CO2, 1 mM EDTA, 0,2% SDS) aan de gel slush toevoegen. Draaien van buizen voor een minimum van 3 uur (‘s nachts is aanvaardbaar) op RT met een mixer eind over. Gebruik een schone pincet set één kleine ronde glazen vezel filter toevoegen aan centrifuge kolommen met cellulose acetaat membraanfilters (0,2 µm), die voorkomt verstopping van het membraan. Zet het filter in plaats met een omgekeerde Pipetteer tip. Kort draaien de 2 mL buisjes met gel slush en extractie buffer in een microcentrifuge en 700 µL van het supernatans overbrengen in de kolommen bereid filter. Houd de gel slush en resterende supernatant. Centrifugeer het filter kolommen in een microcentrifuge op topsnelheid voor 1 min. overdracht de flowthrough in een nieuwe 2.0 mL microcentrifuge buis. Herlaad de kolommen met de resterende bovendrijvende substantie. Proberen te krijgen van zo veel vloeistof mogelijk bij de winning slush. Overdracht van gel stukken uitmaakt niet. Spin opnieuw en flowthroughs van de dezelfde extractie monsters te combineren. DNA neerslag Voeg 3 µL van polyA RNA (1 µg/µL; als een drager), 1 µL van glycogeen en 0,7 mL isopropanol en aan de flowthrough uit stap 4.3.5. Vortex kort en bevriezing bij-80 ° C’s nachts. Monsters te nemen uit de vriezer-80 ° C en laat ze ontdooien kort. Leg ze in een gekoeld (4 ° C) microcentrifuge en spin voor 30 min op topsnelheid. Verwijderen en verwijder het supernatant. Wees zeer voorzichtig niet te verwijderen van de pellet. Laat 30 tot 50 µL van vloeistof als het is niet zeker dat pellet anders zou worden verwijderd.Opmerking: Doorgaans alle “hoge” monsters blijkt een zichtbaarder pellet dan “Midden” en “laag” monsters. Voeg 800 µL van 80% ethanol. Omkeren van buizen en spin weer voor 1 min op topsnelheid. Verwijderen van de meerderheid van ethanol met een pipet kort de buizen weer draaien en verwijderen meer ethanol met een kleiner volume pipet. Laat alle resterende ethanol verdampen door het plaatsen van de buizen met een open deksel in een blok van de droge hitte 55 ° C. Wanneer monsters zijn droog (2-4 min) Voeg 20 µL van nuclease-vrije H2O en de verspreiding rond de onderkant van de buis om ervoor te zorgen de DNA-pellet wordt ontbonden. Het DNA-monster kan worden opgeslagen bij-20 ° C. 5. PCR versterking en voorbereiding van de bibliotheek Een 40 µL van het PCR reactie met 20 µL van de polymerase van DNA pre-mix ingesteld, 18 µL van geprecipiteerde en redissolved DNA uit stap 4.4.5, 1 µL voorste primer “MP1.0 + 22HIV” (10µM) (Zie tabel 1), en 1 µL van multiplex oligo inleidingen (index inleidingen 1 tot en met 24) (zie tabel van Ma materialen).Opmerking: Voer dat de drie reacties (laag, mid, hoge) van elk monster in aparte PCR reacties, maar met dezelfde geïndexeerd primer. Gebruik een andere index voor elk van de originele exemplaren van de infectie. De PCR reacties onder de volgende omstandigheden worden uitgevoerd: 2 min op 94 ° C denaturatie, dan 18 cycli van 3-staps PCR; 15 s bij 94 ° C denaturatie, 15 s gloeien bij 55 ° C en 30 s uitbreiding bij 68 ° C. Als een optie voor kwaliteitscontrole, analyseren van PCR reacties met hoge gevoeligheid geautomatiseerd gel elektroforese systeem. Neem 2 µL van een laag, mid en hoog monster uit te voeren vanaf instructie van de fabrikant.Opmerking: De twee inleidingen moet zichtbaar en vaak uitvoeren op een berekende lengte van over 45 en 95 nt (werkelijke lengte verschilt). Bovendien DNA moet worden gevonden tussen 150 tot 500 nt. Als geen signaal aanwezig is, is het raadzaam om toe te voegen extra cycli van PCR, tussen 2 en 10 extra cycli. Voeg geen extra cycli voor de oligonucleotide controlemonsters gemaakt in stap 3.3.2. Schakel de inleidingen gebruiken een paramagnetisch kraal gebaseerde PCR schoonmaak systeem. Neem 20 µL van elke PCR-reactie en bundelen van de monsters samen (Meng alle monsters op dit punt). De resterende 20 µL reacties bevriezen als back-ups bij-20 ° C. Laat de paramagnetisch kralen komen aan RT en meng de gepoolde PCR reacties met 1,8 x het volume van de oplossing van de kraal. Meng door pipetteren en incubeer gedurende 5 min.Opmerking: Als een voorbeeld, als 4 monsters werden voorbereid en elk laag, mid en hoog reacties hebben, het volume zou 4 x 3 x 20 µL = 240 µL PCR reacties met een 432 µL kraal oplossing. Zet de buizen op een microcentrifuge buis magneet, laat de kralen binden voor ~ 1 min en opstijgen het supernatant moet worden verwijderd. Laat de buizen aan de magneet en voeg 500 µL van 80% ethanol. Laat de ethanol voor 30 s, vervolgens grondig opstijgen en laat de kralen airdry voor ~ 5 min. Voeg 40 µL van nuclease-vrije H2O, nemen de buizen uit de magneet en Pipetteer op en neer meerdere keren. Laat de schorsing voor 5 min. Zet de buis terug op de magneet, laat de kralen regelen naar de kant en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis. Dit is de bibliotheek. Neem een 10 µL aliquoot voor kwaliteitscontroles en het bevriezen van de rest bij-20 ° C. 6. evaluatie van de bibliotheek Het bepalen van de kwaliteit van de bibliotheek, concentratie en molarity. Gebruik een fluorimetrische kwantificering methode. Meten 1 µL en 3 µL van de bibliotheek met een hoge gevoeligheid dsDNA assay kit volgens instructies van de fabrikant.Opmerking: Typische concentraties zijn tussen 1 en 10 ng/µL. Maatregel de bibliotheek DNA molecuulgewicht spectrum door hoge gevoeligheid geautomatiseerd gelelektroforese zoals hierboven (stap 5.2) beschreven. Gebruik de geautomatiseerde gel elektroforese analyse om te bepalen van het gemiddelde molecuulgewicht van de bibliotheek en berekenen om te verdunnen van de bibliotheek in nuclease-vrije H2O tot en met 4 nM. Verschillende bibliotheken kunnen worden gecombineerd, zolang alle indices uniek zijn. Optionele lage doorvoersnelheid kwaliteitscontrole De bibliotheek van DNA onverminderd TA klonen19 bibliotheek moleculen in vectoren voor versterking invoegen. Volg de instructies van de kit, groeien ~ 10-20 kolonies en uittreksel via miniprep de protocollen van DNA, zoals beschreven hier20. Reeks vector met lokale sequencing services en check dat de inserts de gewenste HIV-1 bevatten afgeleide reeksen en de bibliotheek-specifieke adapters. 7. high-Throughput Sequencing Run Een sequencing monster vel maken met de commerciële software geleverd bij de sequencing-platform. Aangeven van de geselecteerde sequentie-kit. Meestal kiezen een 150-cyclus-kit, maar anderen zijn afhankelijk van de gewenste Lees lengte geschikt. Selecteer “Alleen Fastq” als de werkstroom toepassing. Kies een van de sjablonen die de 24 indices aanwezig in de multiplex oligonucleotide kits (aangegeven in de handleiding van de kit) bevat. Selecteer “25 nt” voor Read1 en “125 nt” voor Read2. Houd 6 nt voor enkele index lezen.Opmerking: In de interne analyse alleen Read2 wordt gebruikt in de analyse. Read1 houden bij een minimum van 25 nt voor sequencing platform algoritme doeleinden. Volg de instructies van de fabrikant van juist voor de vooraf uitvoeren bibliotheek voorbereiding en setup. Kiezen voor de maximale 20 pM concentratie en gebruik een 15% PhiX piek, als de bibliotheek van zeer lage complexiteit is. 8. de gegevensanalyse Controleer of het pass filter percentage en de gemiddelde score van de kwaliteit van de Q30 aanvaardbaar volgens de rangschikking van de fabrikant van het platform de richtsnoeren.Opmerking: Pass filter is meestal > 90% en Q30 scores zijn doorgaans > 80%. Download de. fastq.gz bestanden vanuit de fabrikant sequencing hub. De sequencing-script instellen Maak een nieuwe map (map) met de naam “AnalysisXYZ” en ga naar https://github.com/malimlab/seqparse voor het downloaden van alle broncode-bestanden (parse_sam.pl, rc_extract.pl, parse.sh) in deze map. Download de korte-lezen aligner Bowtie, versie 1.1.2, van http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml in de zelfde folder. De download maakt u een submap binnen de “AnalysisXYZ”, “Bowtie-1.1.2” genoemd. Binnen deze map openen subdirectory “indexen” en downloaden van de sequenties van de meegeleverde sjabloon bestaande uit 6 bestanden met de extensies van de .ebwt. Download de FASTQ/A korte leest voorbehandeling toolkit fastx-0.0.13 van http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html in de map “AnalysisXYZ”. Download zowel Samtools (https://sourceforge.net/projects/samtools/files/) en bam-readcount (https://github.com/genome/bam-readcount) naar de directory “Documenten”. Verplaats de. fastq.gz bestanden, gedownload in stap 8.2, van alle gelezen 2s (eindigend op… _R2_001.fastq.gz) naar de map “AnalysisXYZ”. Open de command console/terminal. Verplaatsen naar de “AnalysisXYZ” als de huidige directory met behulp van cd commando’s. Type “./parse.sh.” de scripts uit te voeren. Vindt de bestanden met samenvattingen van de .csv voor alle monsters op totale Lees graven, lengte aangepast lezen graven, en normaliseert Lees graven, evenals bestanden met de basis variatie, voor elk monster in een map met de naam parse_results binnen de folder van de “Analyse XYZ”.Opmerking: Zie de discussie voor meer informatie over het analyseproces. Het script retourneert csv bestanden met totale leest voor elk nucleotide langs de HIV-1NL4.3 sterke-stop sequenties en eerste strand overdracht tot nucleotide 635. Als richtsnoer, worden 50.000 tot 100.000 unieke leest doorgaans waargenomen in monsters van infecties met de vermelde cel nummers en virale entmateriaal en zonder antivirale eiwitten of verbindingen. De oligonucleotide controlemonster produceert meestal 100.000 tot 200.000 leest.