Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı
Summary
Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.
Abstract
Kripokus enfeksiyonunu simüle etmek için, ortamdaki kripokal hücrelerin doğal yırtıcı olan Amoeba, makrofajlar için bir model olarak kullanılabilir. Bu yırtıcı organizma, makrofajlar benzer, dışkılmış hücreleri öldürmek için fagositoz istihdam. Konfeti lazer tarama mikroskobu yardımıyla, kripokal hücreler ve anipin arasındaki interaktif anları tasvir eden görüntüler yakalanır. Elektron mikroskobu çözünürlük gücü, aynı zamanda, amip gıda vakum içinde sıkışıp zaman kripokal hücrelerin ultrastran detay açığa yardımcı olur. Fagositoz sürekli bir süreçtir olduğundan, nicel veriler daha sonra bir görüntü yakalanır zaman noktasında ne olduğunu açıklamak için analiz entegre edilir. Spesifik olmak için, kripokal hücrelerde ayipliğin verimliliğini ölçmek için göreceli floresans üniteleri okunur. Bu amaçla, kriptozal hücreler onları bir kez gıda vakidinin asidik çevre içinde sıkışıp floresan kılan bir boya ile lekelenmiş. Birlikte kullanıldığında, bu tür teknikler aracılığıyla toplanan bilgiler, diğer fagositik hücreler tarafından, belki de, amip tarafından ve, muhtemelen, davranış ve hücrelerin kaderi üzerine sonuçlar çekmeye yardımcı olmak için kritik bilgiler sağlayabilir.
Introduction
Mikroplar, toprak ve suyun açık fiziksel sınırları gibi farklı ekolojik niceler içinde işgal ve gelişmek için zaman içinde evrimleşmiş, diğerleri arasında1. Bu niş, mikroplar genellikle sınırlı kaynaklar için doğrudan rekabet meşgul; önemlisi, onlar genişleyen nüfus2,3karşılamak için gereken onların büyüme veya boşluk, desteklemek için kullanılan besin için. Bazı durumlarda, amip gibi bazı holozotik organizmalar, biyokütle4,5‘ ten besin çıkarma yolu olarak kripokal hücrelerde bile öncesine olabilir. Buna göre, bu tür organizmaların avının nüfus numaralarını kontrol ederek toprak hakimiyeti kurmayı sağlar. Bu yırtıcı basınç nedeniyle, bazı av mikrobiyal faktörler üretmek için seçilebilir, örneğin kripokel kapsül6, basınç olumsuz etkilerini karşılaştırmak için. Ancak, bu basıncının istenmeyen bir sonucu olarak, bazı mikroplar türler bariyerini geçmek ve yeni niş aramak için izin faktörler elde 7, kolonize etmek içinyedi, besin zengin ve ideal olan insan vücudunun sınırlı alanlar gibi Koşul -ları. İkincisi nasıl bir karasal mikrobe gibi açıklamak olabilir Kripokus (C.) neoformanlar patojenik olmaya dönüşebilir.
Bu amaçla, kripokal hücrelerin amip ile olabilir ve bu onları patojen olmak için nasıl seçebilir ilk temas çalışması önemlidir. Daha spesifik olarak, bu kripokal hücrelerin enfeksiyon sırasında makrofajlar üzerine hareket ettiğinde nasıl davrandığını hakkında ipuçları verebilir. Bu nedenle, bir laboratuar8‘ de bir asit kültürünü korumak için nispeten ucuz ve kolay olduğu için, bu nedenle, burada makrofajlar için bir model olarak seçildi. Ayrıca nasıl kripokal ikincil metabolitleri incelemek için ilgi oldu. 3-hidroksi yağ asitleri9,10 amipler ve kripokal hücreler arasındaki etkileşimi etkiler.
Ayağın ve avının çıplak gözle arasındaki etkileşimi algılayanın basit bir yolu, bir agar plaka ve spot amip yüzeyinde avını kullanarak bir çim yaratmaktır. Agar plakasında plaklar veya net bölgelerin görselleştirilmesi, avında amoipin beslenmesi gereken alanları tasvir eder. Ancak, bu makro düzeyinde, yalnızca işlemin sonucu belirtilir ve fagositoz sürecinin mekanize edilmesi görülmez. Bu nedenle, hücre-hücre temelinde süreci takdir etmek için,11,12kullanılabilecek birkaç mikroskobik yöntemler vardır. Örneğin, bir inkübasyon odası ile ters bir mikroskop bir fagositik hücre ve hedef13arasındaki olayların zaman aşımı video kayıt için kullanılabilir. Ne yazık ki, bir zaman atlamalı işlevselliği ile mikroskop maliyeti nedeniyle, laboratuvarlar özellikle kaynak yoksul ayarları, böyle bir mikroskop satın almak için her zaman mümkün değildir.
Yukarıdaki sınırlamanın aşılması için, bu çalışmada c. neoformans , c. neoformans uofs Y-1378 ve c. neoformans Lmpe 046 ile Acanthamoeba Castellani ile etkileşimini değerlendiren sıralı bir araştırmacı tasarım sunulur. . İlk olarak, nicel bir yöntemin önündeki niteliksel bir yöntem kullanılır. Hala görüntüleri ters floresan mikroskop, yanı sıra bir iletim elektron mikroskop kullanarak yakalanır Amoeba-Kripoccus etkileşimleri tasvir. Bu, kripokal hücreleri içerize etmek için ayağın verimliliğini tahmin etmek için bir plaka okuyucusu kullanarak floresans ölçülerek izledi. Veri yorumlama aşamasında bu yöntemlerden gelen bulguları mutabakatın zaman, bu eşit bir fagositoz zaman atlamalı video perusing olarak çok kritik bilgi ortaya çıkabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gazetede, ayip kripokal hücrelerle etkileşirken ortaya çıkabilecek olası sonucu ortaya çıkarmak için farklı teknikler başarıyla kullanıldı. Ayrıca, biz kripto Occussonucu 3-hidroksi yağ asitleri etkilerini göstermek için ilgilendi-Amoeba etkileşimleri.
Kullanılan ilk tekniği, hala görüntüler işlenmiş Konfokal mikroskobu oldu. Bu tekniğin önemli dezavantajı, sadece bize belirli bir timepoint ile sınırlı bilgi veriyordu. Sonuçları dayalı çizilmiş olab…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Güney Afrika Ulusal Araştırma Vakfı (Grant numarası: UID 87903) ve serbest Devlet Üniversitesi ‘nden bir hibe tarafından destekleniyordu. Ayrıca mikroskopi çalışmalarımız sırasında Pieter Van Wyk ve Hanlie Grobler tarafından sunulan hizmetler ve yardımlar için minnettarız.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
