Uso complementario de técnicas microscópicas y lectura de fluorescencia en el estudio de las interacciones Cryptococcus-Amoeba
Summary
Este artículo detalla un protocolo para preparar un cocultivo de células criptocócicas y amebas que se estudia utilizando imágenes fijas fluorescentes e imágenes de microscopio electrónico de transmisión de alta resolución. Aquí se ilustra cómo los datos cuantitativos pueden complementar esa información cualitativa.
Abstract
Para simular la infección por Cryptococcus, la ameba, que es el depredador natural de las células criptocócicas en el entorno, se puede utilizar como modelo para macrófagos. Este organismo depredador, similar a los macrófagos, emplea fagocitosis para matar las células internalizadas. Con la ayuda de un microscopio de exploración láser confocal, se capturan imágenes que representan momentos interactivos entre las células criptocócicas y la ameba. La potencia de resolución del microscopio electrónico también ayuda a revelar el detalle ultraestructural de las células criptocócicas cuando están atrapadas dentro de la vacuola de alimentos de la ameba. Dado que la fagocitosis es un proceso continuo, los datos cuantitativos se integran en el análisis para explicar lo que sucede en el momento en que se captura una imagen. Para ser específicos, se leen unidades de fluorescencia relativa para cuantificar la eficiencia de la ameba en la internalización de las células criptocócicas. Para este propósito, las células criptocócicas se tiñen con un tinte que las hace fluorescencia una vez atrapadas dentro del ambiente ácido de la vacuola alimentaria. Cuando se utiliza en conjunto, la información recopilada a través de estas técnicas puede proporcionar información crítica para ayudar a sacar conclusiones sobre el comportamiento y el destino de las células cuando se internalizan por la ameba y, posiblemente, por otras células fagocíticas.
Introduction
Los microbios han evolucionado con el tiempo para ocupar y prosperar en diferentes nichos ecológicos como los límites físicos abiertos del suelo y el agua, entre otros1. En estos nichos, los microbios a menudo participan en la competencia directa por recursos limitados; importante, para los nutrientes que utilizan para apoyar su crecimiento o espacio,que necesitan para acomodar a la población en expansión 2,3. En ciertos casos, algunos organismos holozoicos como la ameba pueden incluso ser anteriores a las células criptocócicas como una forma de extraer nutrientes de su biomasa4,5. A su vez, esto permite a estos organismos establecer el dominio territorial mediante el control del número de población de su presa. Debido a esta presión depredadora, algunas presas pueden ser seleccionadas para producirfactores microbianos, como la cápsula criptocócica 6, para conciliar los efectos negativos de la presión. Sin embargo, como consecuencia involuntaria de esta presión, algunos microbios adquieren factores que lespermiten cruzar la barrera de las especies y buscar nuevos nichos para colonizar 7, como los espacios confinados del cuerpo humano que son ricos en nutrientes y tienen ideal Condiciones. Este último puede explicar cómo un microbio terrestre como Cryptococcus (C.) neoformans pueden transformarse para convertirse en patógenos.
Con este fin, es importante estudiar el contacto inicial que las células criptocócicas pueden tener con la ameba y cómo esto puede seleccionarlas para convertirse en patógenas. Más específicamente, Esto puede dar pistas sobre cómo se comportan las células criptocócicas cuando se actúa sobre los macrófagos durante la infección. Es por esta razón que la ameba fue elegida como modelo para macrófagos aquí, ya que es relativamente barato y fácil de mantener un cultivo de ameba en un laboratorio8. De interés era también examinar cómo los metabolitos secundarios criptococcales viz. 3-hidroxi ácidos grasos9,10 influyen en la interacción entre las amebas y las células criptocócicas.
Una forma sencilla de percibir la interacción entre la ameba y su presa a simple vista es crear un césped usando su presa en la superficie de una placa de agar y ameba plana. La visualización de placas o zonas claras en la placa de agar representa áreas donde la ameba puede haberse alimentado de su presa. Sin embargo, a este nivel macro, sólo se observa el resultado del proceso, y el proceso de fagocitosis se mecaniza no se puede observar. Por lo tanto, para apreciar el proceso de célula a célula, hay varios métodos microscópicos que se pueden utilizar11,12. Por ejemplo, un microscopio invertido con una cámara de incubación se puede utilizar para grabar en vídeo un lapso de tiempo de eventos entre una célula fagocítica y su objetivo13. Desafortunadamente, debido al costo de un microscopio con una funcionalidad de lapso de tiempo, no siempre es posible que los laboratorios compren un microscopio de este tipo, especialmente en entornos de recursos deficientes.
Para eludir la limitación anterior, este estudio presenta un diseño exploratorio secuencial que evalúa la interacción de C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 y C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . En primer lugar, se utiliza un método cualitativo que precede a un método cuantitativo. Las imágenes fijas se capturan utilizando un microscopio de fluorescencia invertida, así como un microscopio electrónico de transmisión para representar interacciones de ameba-Cryptococcus. Esto fue seguido por la cuantificación de la fluorescencia utilizando un lector de placas para estimar la eficiencia de la ameba para internalizar las células criptocócicas. Al conciliar los hallazgos de estos métodos durante la etapa de interpretación de datos, esto puede revelar tanta información crítica como la de la aplicación de un vídeo de lapso de tiempo de fagocitosis.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el documento, se emplearon con éxito diferentes técnicas para revelar el posible resultado que puede surgir cuando la ameba interactúa con las células criptocócicas. También, estábamos interesados en mostrar los efectos de los ácidos grasos 3-hidroxi en el resultado de las interacciones Cryptococcus-amoeba.
La primera técnica utilizada fue la microscopía confocal, que representaba imágenes fijas. El principal inconveniente de esta técnica aquí fue que sólo nos dio inf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Sudáfrica (número de subvención: UID 87903) y la Universidad del Estado Libre. También estamos agradecidos con los servicios y la asistencia ofrecidos por Pieter van Wyk y Hanlie Grobler durante nuestros estudios de microscopía.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
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