Дополнительное использование микроскопических методов и флуоресценции Чтение в изучении Cryptococcus-Amoeba Взаимодействия
Summary
В этой статье подробно описывается протокол для подготовки совместной культуры криптококковых клеток и амеб, которые изучаются с использованием неподвижных флуоресцентных изображений и изображений электронного микроскопа с высоким разрешением передачи. Здесь показано, как количественные данные могут дополнять такую качественную информацию.
Abstract
Для имитации инфекции криптококка амеба, которая является естественным хищником криптококковых клеток в окружающей среде, может быть использована в качестве модели для макрофагов. Этот хищный организм, похожий на макрофаги, использует фагоцитоз, чтобы убить интернализированные клетки. С помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, изображения, изображающие интерактивные моменты между криптококковых клеток и амебы, захвачены. Разрешение мощности электронного микроскопа также помогает выявить ультраструктурные детали криптококковых клеток, когда в ловушке внутри амебы пищи vacuole. Поскольку фагоцитоз является непрерывным процессом, количественные данные затем интегрируются в анализ, чтобы объяснить, что происходит в момент захвата изображения. Чтобы быть конкретным, относительные флуоресценции единицы считываются для того, чтобы количественно эффективность амебы в интернализации криптококковых клеток. Для этой цели, криптококковые клетки окрашены красителем, что делает их флуоресценции раз в ловушке внутри кислой среде пищи vacuole. При использовании вместе, информация, собранная с помощью таких методов может предоставить важную информацию, чтобы помочь сделать выводы о поведении и судьбе клеток, когда интернализированы амебы и, возможно, другими фагоцитическими клетками.
Introduction
Микробы развивались с течением времени, чтобы занять и процветать в различных экологических нишах, таких как открытые физические границы почвы и воды, среди других1. В этих нишах микробы часто участвуют в прямой конкуренции за ограниченные ресурсы; важно, для питательных веществ, которые они используют для поддержки их роста или пространства, которые они должны учитывать расширение населения2,3. В некоторых случаях, некоторые голозоики организмов, как амеба может даже предшествовать на криптококковых клеток, как способ извлечения питательных веществ из их биомассы4,5. Это, в свою очередь, позволяет таким организмам устанавливать территориальное господство путем контроля за численностью населения своей добычи. Из-за этого хищного давления, некоторые жертвы могут быть выбраны для производства микробных факторов, таких как криптококковой капсулы6, чтобы примирить негативные последствия давления. Однако, как непреднамеренное последствие этого давления, некоторые микробы приобретают факторы, которые позволяют им пересечь видовой барьер и искать новые ниши для колонизации7, как ограниченные пространства человеческого тела, которые богаты питательными веществами и имеют идеальный Условия. Последний может объяснить, как наземный микроб,как Cryptococcus (C .) neoformans может трансформироваться, чтобы стать патогенным.
С этой целью важно изучить первоначальный контакт, который могут иметь криптококковые клетки с амебой, и как это может выбрать их, чтобы стать патогенными. В частности, это может дать подсказки о том, как криптококковые клетки ведут себя, когда действуют макрофаги во время инфекции. Именно по этой причине, что амеба была выбрана в качестве модели для макрофагов здесь, так как это относительно дешево и легко поддерживать культуру амебы в лаборатории8. Интерес был также изучить, как криптококковые вторичные метаболиты viz. 3-гидрокси жирные кислоты9,10 влияют на взаимодействие между амебами и криптококковых клеток.
Простой способ воспринимания взаимодействия между амебой и ее добычей невооруженным глазом заключается в создании газона, используя свою добычу на поверхности агаровой пластины и пятно амебы. Визуализация бляшек или четких зон на агарной плите изображает области, где амеба, возможно, кормили свою добычу. Однако на этом макроуровне отмечается только результат процесса, а процесс механизации фагоцитоза не может быть соблюден. Таким образом, чтобы оценить процесс на основе клеток к клетке, Есть несколько микроскопических методов, которые могут быть использованы11,12. Например, перевернутый микроскоп с инкубационной камерой может быть использован для видеозаписи замедленного действия событий между фагоцитарной клеткой и ее целью13. К сожалению, из-за стоимости микроскопа с замедленной функциональностью, не всегда возможно для лабораторий приобрести такой микроскоп, особенно в ресурсах бедных параметров.
Чтобы обойти вышеупомянутое ограничение, это исследование представляет последовательный исследовательский дизайн, который оценивает взаимодействие C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 и C. neoformans LMPE 046 с Acanthamoeba castellani . Во-первых, используется качественный метод, который предшествует количественному методу. Тем не менее изображения захвачены с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа, а также электронный микроскоп передачи, чтобы изобразить амебы-Cryptococcus взаимодействий. За этим последовала количественная флуоресценция с помощью считывателя пластин для оценки эффективности амебы для интернализации криптококковых ячеек. При согласовании выводов этих методов на этапе интерпретации данных, это может в равной степени выявить столько критической информации, как просматривая фагоцитоз замедленного видео.
Protocol
Representative Results
Discussion
В статье были успешно использованы различные методы, чтобы выявить возможный результат, который может возникнуть при взаимодействии амебы с криптококковой клетки. Кроме того, нам было интересно показать влияние 3-гидрокси жирных кислот на исход взаимодействия Cryptococcus-amoeba.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана грантом Национального исследовательского фонда южной Африки (номер гранта: UID 87903) и Университета Свободного государства. Мы также благодарны за услуги и помощь, предлагаемые Питером ван Виком и Ханли Гроблер во время наших исследований микроскопии.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
