Uso complementare di tecniche microscopiche e lettura di fluorescenza nello studio delle interazioni Cryptococcus-Amoeba

I microbi si sono evoluti nel tempo per occupare e prosperare in diverse nicchie ecologiche come i confini fisici aperti del suolo e dell’acqua, tra gli altri¹. In queste nicchie, i microbi spesso si impegnano nella competizione diretta per risorse limitate; importante, per i nutrienti che usano per sostenere la loro crescita o lo spazio, che hanno bisogno di ospitare la popolazione in espansione^2,3. In alcuni casi, alcuni organismi olozoici come l’ameba possono anche precedere le cellule criptococcali come un modo per estrarre sostanze nutritive dalla loro biomassa^4,5. A sua volta, questo permette a tali organismi di stabilire il dominio territoriale attraverso il controllo del numero di popolazione della sua preda. A causa di questa pressione predatoria, alcune prede possono essere selezionate per produrre fattori microbici, come la capsula criptococcale⁶, per riconciliare gli effetti negativi della pressione. Tuttavia, come conseguenza involontaria di questa pressione, alcuni microbi acquisiscono fattori che permettono loro di attraversare la barriera delle specie e cercare nuove nicchie per colonizzare⁷, come gli spazi confinati del corpo umano che sono ricchi di sostanze nutritive e hanno l’ideale Condizioni. Quest’ultimo può spiegare come un microbo terrestre come Cryptococcus (C.) i neoforman possono trasformarsi per diventare patogeni.

A tal fine, è importante studiare il contatto iniziale che le cellule criptococcali possono avere con ameba e come questo può selezionarli per diventare patogeni. Più specificamente, Questo può dare indizi su come le cellule criptococcali si comportano quando agito su macrofagi durante l’infezione. È per questo motivo che l’ameba è stata scelta come modello per i macrofagi qui, in quanto è relativamente economico e facile mantenere una cultura dell’ameba in un laboratorio⁸. Di interesse era anche quello di esaminare come i metaboliti secondari criptococcali viz. 3-idrossici acidi grassi^9,10 influenzano l’interazione tra amebe e cellule criptococcali.

Un modo semplice per percepire l’interazione tra ameba e la sua preda ad occhio nudo è quello di creare un prato utilizzando la sua preda sulla superficie di un piatto di agar e avvistare l’ameba. La visualizzazione di placche o zone chiare sulla piastra di agar raffigura aree in cui l’ameba può essersi nutrita della sua preda. Tuttavia, a questo macro livello, si nota solo l’esito del processo e il processo di fagocitosi è meccanizzato non può essere osservato. Pertanto, per apprezzare il processo da cellula a cellula, ci sono diversi metodi microscopici che possono essere utilizzati^11,12. Ad esempio, un microscopio invertito con una camera di incubazione può essere utilizzato per registrare video di eventi tra una cellula fagocitica e il suo obiettivo¹³. Purtroppo, a causa del costo di un microscopio con una funzionalità time-lapse, non è sempre possibile per i laboratori acquistare un tale microscopio, soprattutto nelle impostazioni di scarso spazio.

Per aggirare la limitazione di cui sopra, questo studio presenta un disegno esplorativo sequenziale che valuta l’interazione di C. neoformans viz C. neoformans UOFS Y-1378 e C. neoformans LMPE 046 con Acanthamoeba castellani . In primo luogo, viene utilizzato un metodo qualitativo che precede un metodo quantitativo. Le immagini fisse vengono catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito, così come un microscopio elettronico di trasmissione per rappresentare le interazioni ameba-Cryptococcus. Questo è stato seguito dalla quantificazione della fluorescenza utilizzando un lettore di lamiere per stimare l’efficienza dell’ameba per internalizzare le cellule criptococcali. Quando si riconciliano i risultati di questi metodi durante la fase di interpretazione dei dati, ciò può rivelare anche tutte le informazioni critiche come l’utilizzo di un video time-lapse di fagocitosi.