שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות
Summary
נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.
Abstract
כדי לדמות זיהום קריפטוקוקוס , אמבה, אשר הוא טורף טבעי של תאים cryptococcal בסביבה, יכול לשמש כמודל עבור מקרופאגים. זה אורגניזם טורף, דומה מקרופאגים, מעסיקה phagocyציטוזה כדי להרוג תאים הפנימו. בעזרתו של מיקרוסקופ לייזר ממוקד סריקה, תמונות המתארים רגעים אינטראקטיביים בין תאים cryptococcal ו אמבה נלכדים. הכוח החלטה של מיקרוסקופ אלקטרון גם מסייע לחשוף את הפרטים בדיקת אולטרה מבנית של תאים cryptococcal כאשר לכודים בתוך מזון אמבה ולאחר. מאז phagocyציטוזה הוא תהליך רציף, נתונים כמותיים משולבים אז בניתוח כדי להסביר מה קורה בנקודת הזמן כאשר התמונה נלכדה. כדי להיות ספציפיים, יחידות הזריחה יחסית נקראים על מנת לכמת את היעילות של אמבה הפנמה תאים cryptococcal. למטרה זו, תאים cryptococcal מוכתמים בצבע שהופך אותם זרוח פעם לכודים בתוך הסביבה החומצית של המזון ולבולית. כאשר נעשה שימוש יחד, מידע שנאסף באמצעות טכניקות כאלה יכול לספק מידע קריטי כדי לעזור להסיק מסקנות על ההתנהגות ועל גורלם של תאים כאשר הפנפו על ידי אמבה, ואולי, על ידי תאי phagocytic אחרים.
Introduction
החיידקים התפתחו לאורך זמן כדי לכבוש ולשגשג נישות אקולוגיות שונות כגון הגבולות הפיזיים פתוח של הקרקע והמים, בין היתר1. בגומחות אלה, חיידקים לעתים קרובות לעסוק בתחרות ישירה עבור משאבים מוגבלים; חשוב מכך, עבור חומרים מזינים שהם משתמשים בהם לתמיכה בצמיחה או במרחב שלהם, שהם צריכים להתאים לאוכלוסיה המתרחבת2,3. במקרים מסוימים, כמה אורגניזמים הולואיקון כמו אמבה אולי אפילו קדומים על התאים cryptococcal כדרך לחילוץ חומרים מזינים מתוך ביומסה שלהם4,5. בתורו, זה מאפשר אורגניזמים כאלה להקים שליטה טריטוריאלית באמצעות שליטה על מספר האוכלוסייה של טרפו. בגלל הלחץ הטורף הזה, אפשר לבחור טרף כדי לייצר גורמים מיקרוביאלית, כמו כמוסה הקריפטוקוקאל6, כדי ליישב את ההשפעות השליליות של הלחץ. עם זאת, כתוצאה בלתי מכוונת של לחץ זה, כמה חיידקים לרכוש גורמים המאפשרים להם לחצות את מחסום המינים ולחפש נישות חדשות ליישב7, כמו חללים סגורים של גוף האדם כי הם עשירים בחומרים מזינים יש אידיאלי תנאים. האחרון עשוי להסביר כיצד חיידק יבשתי כמו קריפטוקוקוס (C.) נאופורמנים יכולים להפוך. להיות פתוגניים
לשם כך, חשוב ללמוד את הקשר הראשוני כי תאים cryptococcal עשוי להיות עם אמבה וכיצד זה יכול לבחור אותם להיות פתוגניים. באופן ספציפי יותר, זה עשוי לתת רמזים על איך תאים cryptococcal להתנהג כאשר פעלו על ידי מקרופאגים במהלך הזיהום. זה בגלל הסיבה כי אמבה נבחרה כמודל עבור מקרופאגים כאן, כפי שהוא זול יחסית קל לשמור על תרבות של אמבה במעבדה8. העניין היה גם לבדוק כיצד הקריפטוקותא משנית משני מטבוליטים. 3-חומצות שומן הידרורוקסי9,10 להשפיע על האינטראקציה בין אמבות ותאי cryptococcal.
דרך פשוטה של תפיסת האינטראקציה בין אמבה וטרפו עם עין בלתי היא ליצור מדשאה באמצעות טרפו על פני השטח של צלחת אגר ואמבה ספוט. ויזואליזציה של לוחיות או אזורים ברורים על צלחת אגר מתאר אזורים שבהם אמבה אולי ניזון טרף שלה. עם זאת, ברמת מאקרו זו, רק את תוצאת התהליך הוא ציין, והתהליך של phagocyציטוזה הוא ממוכן לא ניתן לצפות. לכן, כדי להעריך את התהליך על בסיס תא-לתא, ישנן מספר שיטות מיקרוסקופיים שניתן להשתמש בהן11,12. לדוגמה, מיקרוסקופ הפוך עם תא דגירה יכול לשמש להקליט וידאו לשגות זמן של אירועים בין תא phagocytic היעד שלה13. למרבה הצער, בשל העלות של מיקרוסקופ עם פונקציונליות זמן לשגות, זה לא תמיד אפשרי מעבדות לרכוש כזה מיקרוסקופ, במיוחד במשאבים עניים-הגדרות.
כדי לעקוף את המגבלה שלעיל, מחקר זה מציג עיצוב סדרתי שמעריך את האינטראקציה של ה- c. neoformans מק. נאופורמנים 1378 ו- c. neoformans Lmpe 046 עם הקואקאואמבה קסטאני . ראשית, נעשה שימוש בשיטה איכותית הקודמת לשיטה כמותית. תמונות סטילס לכוד באמצעות מיקרוסקופ הפוך מעין פלואורסצנטית, כמו גם מיקרוסקופ אלקטרון שידור לתאר את האינטראקציות אמבה-קריפטוקוקוס . זה היה לאחר מכן על ידי כימות זריחה באמצעות קורא צלחת להעריך את היעילות של אמבה להפנים תאים cryptococcal. כאשר ליישב ממצאים משיטות אלה בשלב פרשנות הנתונים, זה עשוי לחשוף באופן שווה את המידע הקריטי הרבה כמו pergocyציטוזה מעידה בזמן וידאו.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעיתון, טכניקות שונות המועסקים בהצלחה כדי לחשוף את התוצאה האפשרית שעלולים להתעורר כאשר אמבה אינטראקציה עם תאים cryptococcal. כמו כן, היינו מעוניינים להראות את ההשפעות של חומצות שומן 3-הידרורוקסי על התוצאה של אינטראקציות של הקריפטוקוקוס-אמבה.
הטכניקה הראשונה שהייתה בשימוש ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכת על ידי מענק מקרן המחקר הלאומי של דרום אפריקה (מספר המענק: UID 87903) והאוניברסיטה של המדינה החופשית. אנו גם אסירי תודה לשירותים ולסיוע המוצעים על ידי פיטר ואן ווינק והנלי גרובלר במהלך לימודי המיקרוסקופיה שלנו.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
