Aanvullend gebruik van microscopische technieken en fluorescentie lezen in het bestuderen van interacties Cryptococcus-amoeba
Summary
Dit papier is een protocol voor de voorbereiding van een co-cultuur van crypto Kokken cellen en eencellige die wordt bestudeerd met behulp van stilstaand, fluorescerende beelden en hoge-resolutie transmissie elektronen microscoop beelden. Hier wordt geïllustreerd hoe kwantitatieve gegevens dergelijke kwalitatieve informatie kunnen aanvullen.
Abstract
Om te simuleren Cryptococcus infectie, Amoeba, dat is de natuurlijke roofdier van crypto Kokken cellen in de omgeving, kan worden gebruikt als een model voor macrofagen. Dit roofzuchtige organisme, vergelijkbaar met macrofagen, maakt gebruik van fagocytose om geïnternationaliseerde cellen te doden. Met behulp van een confocale laser scanning microscoop worden beelden van interactieve momenten tussen crypto Kokken cellen en Amoeba gevangen. Het resolutievermogen van de elektronen microscoop helpt ook om de ultrastructurele Details van crypto Kokken cellen te onthullen wanneer ze in het amoeba voedsel vacuole worden gevangen. Aangezien fagocytose een continu proces is, worden kwantitatieve gegevens vervolgens in de analyse geïntegreerd om uit te leggen wat er op het tijdpunt gebeurt wanneer een afbeelding wordt vastgelegd. Om specifiek te zijn, worden relatieve fluorescentie-eenheden gelezen om de efficiëntie van amoeba bij het internaliseren van crypto Kokken-cellen te kwantificeren. Voor dit doel, crypto Kokken cellen worden gekleurd met een kleurstof die maakt ze fluoresceren eenmaal gevangen in het zure milieu van het voedsel vacuole. Bij samengebruik kan informatie die via dergelijke technieken wordt verzameld, kritieke informatie bieden om conclusies te trekken over het gedrag en het lot van cellen wanneer ze geïnternationaliseerd worden door amoeba en, mogelijk, door andere phagocytische cellen.
Introduction
Microben hebben zich in de loop van de tijd ontwikkeld om te bezetten en gedijen in verschillende ecologische niches zoals de open fysieke grenzen van de bodem en het water, onder andere1. In deze niches zijn microben vaak betrokken bij de directe concurrentie voor beperkte middelen; belangrijk, voor voedingsstoffen die ze gebruiken voor de ondersteuning van hun groei of ruimte, die ze nodig hebben om de groeiende bevolking2,3tegemoet te komen. In bepaalde gevallen kunnen sommige holozoïneorganismen zoals amoeba zelfs op crypto Kokken-cellen worden voorgedate als een manier om voedingsstoffen uit hun biomassa te halen4,5. Op hun beurt, dit maakt het mogelijk dergelijke organismen om territoriale dominantie te vestigen via het beheersen van de populatie aantallen van zijn prooi. Vanwege deze roof druk kunnen sommige prooien worden geselecteerd om microbiële factoren te produceren, zoals de crypto Kokken capsule6, om de negatieve effecten van de druk te verzoenen. Echter, als een onbedoelde gevolg van deze druk, sommige microben verwerven factoren die hen in staat stellen om de soort barrière passeren en zoeken naar nieuwe niches te koloniseren7, zoals de besloten ruimten van het menselijk lichaam die rijk zijn aan voedingsstoffen en hebben ideaal Voorwaarden. De laatste kan uitleggen hoe een terrestrische microbe als Cryptococcus (C.) coccus kan transformeren om pathogeen te worden.
Te dit doel, het is belangrijk om te bestuderen van het eerste contact dat crypto Kokken cellen kunnen hebben met amoeba en hoe dit hen kan selecteren om pathogeen te worden. Specifieker, dit kan aanwijzingen geven over hoe crypto Kokken cellen zich gedragen wanneer ze worden opgevolgd door macrofagen tijdens infectie. Het is om deze reden dat amoeba hier werd gekozen als model voor macrofagen, omdat het relatief goedkoop en gemakkelijk is om een cultuur van amoeba in een laboratorium8te handhaven. Van belang was ook onderzoeken hoe crypto Kokken secundaire metabolieten viz. 3-hydroxy vetzuren9,10 invloed op de interactie tussen eencellige en crypto Kokken cellen.
Een eenvoudige manier om de interactie tussen amoeba en zijn prooi met het blote oog te waarnemen, is het creëren van een gazon met behulp van de prooi op het oppervlak van een agar plaat en spot amoeba. De visualisatie van plaques of heldere zones op de agar plaat toont gebieden waar amoeba op zijn prooi kan hebben gevoed. Echter, op dit macroniveau, alleen de uitkomst van het proces wordt opgemerkt, en het proces van fagocytose is gemechaniseerd kan niet worden waargenomen. Daarom, om het proces op een cel-naar-cel-basis te waarderen, zijn er verschillende microscopische methoden die11,12kunnen worden gebruikt. Een omgekeerde Microscoop met een incubatie kamer kan bijvoorbeeld worden gebruikt om een timelapse van gebeurtenissen tussen een phagocytische cel en zijn doel13op te nemen. Helaas, vanwege de kosten van een microscoop met een time-lapse-functionaliteit, is het niet altijd mogelijk voor laboratoria om een dergelijke Microscoop te kopen, vooral in bron arme instellingen.
Om de bovenstaande beperking te omzeilen, presenteert deze studie een sequentieel verkennend ontwerp dat de interactie van C. coccus viz c. coccus uofs Y-1378 en C. coccus lmpe 046 met Acanthamoeba castellani evalueert. . Ten eerste wordt een kwalitatieve methode gebruikt die voorafgaat aan een kwantitatieve methode. Stilstaande beelden worden vastgelegd met behulp van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop, evenals een transmissie-elektronen microscoop om amoeba-Cryptococcus interacties weer te geven. Dit werd gevolgd door het kwantificeren van fluorescentie met behulp van een plaat lezer om de efficiëntie van amoeba te schatten om crypto Kokken cellen te internaliseren. Bij het afstemmen van de bevindingen van deze methoden tijdens de Data-interpretatie fase, kan dit net zo veel kritieke informatie onthullen als het gebruik van een fagocytose timelapse-video.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het papier, verschillende technieken werden met succes gebruikt om de mogelijke uitkomst die kunnen ontstaan wanneer amoeba interactie met crypto Kokken cellen onthullen. Ook, we waren geïnteresseerd om te laten zien van de effecten van 3-hydroxy vetzuren op het resultaat van de interacties van Cryptococcus-amoeba.
De eerste gebruikte techniek was confocale microscopie, die stilstaande beelden heeft gerenderd. Het grote nadeel van deze techniek was dat het ons alleen informatie ga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gesteund door een subsidie van de National Research Foundation of South Africa (subsidie nummer: UID 87903) en de Universiteit van de Vrijstaat. We zijn ook dankbaar voor diensten en assistentie aangeboden door Pieter van Wyk en Hanlie Grobler tijdens onze microscopie studies.
Materials
| 1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-octane | Sigma-Aldrich | D27802 | – |
| 1.5-mL plastic tube | Thermo Fisher Scientific | 69715 | – |
| 15-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 7252018 | – |
| 50-mL Centrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 1132017 | – |
| 8-Well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 1109650 | – |
| Acetone | Merck | SAAR1022040LC | – |
| Amoeba strain | ATCCÒ | 30234TM | – |
| ATCC medium 712 | ATCCÒ | 712TM | Amoeba medium |
| Black 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 152089 | – |
| Centrifuge | Hermle | – | – |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | – |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon TE 2000 | – |
| Epoxy resin: | |||
| [1] NSA | [1] ALS | [1] R1054 | – |
| [2] DER 736 | [2] ALS | [2] R1073 | – |
| [3] ERL Y221 resin | [3] ALS | [3] R1047R | – |
| [4] S1 (2-dimethylaminoethanol) | [4] ALS | [4] R1067 | – |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F4274 | – |
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | 489441 | – |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Fisher Scientific | 374-91038C | Microplate reader |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | – |
| Glutaraldehyde | ALS | R1009 | – |
| Hemocytometer | Boeco | – | – |
| Lead citrate | ALS | R1209 | – |
| Liquid Chromatography Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | – | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | R 34,860 | – |
| Orbital shaker | Lasec | – | – |
| Osmium tetroxide | ALS | R1015 | – |
| pHrodo Green Zymosan A BioParticles | Life Technologies | P35365 | This is the pH-sensitive dye |
| Physiological buffer solution | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | – |
| Rotary shaker | Labcon | – | – |
| Sodium phosphate buffer: | |||
| [1] di-sodium hydrogen orthophosphate dihydrate | [1] Merck | [1] 106580 | – |
| [2] sodium di-hydrogen orthophosphate dihydrate | [2] Merck | [2] 106345 | |
| Transmission electron microscope | Philips | Philips EM 100 | – |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | – |
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | – |
| Uranyl acetate | ALS | R1260A | – |
| Vacuum dessicator | Lasec | – | – |
| Vial | Sigma-Aldrich | 29651-U | – |
| YNB | Lasec | 239210 | – |
| YPD agar | Sigma-Aldrich | Y-1500 | – |
References
- Barton, L. L., Northup, D. E. . Microbial Ecology. , (2011).
- Hunter, P. Entente cordiale: multiple symbiosis illustrates the intricate interconnectivity of nature. EMBO Reports. 7, 861-864 (2006).
- Comolli, L. R. Intra- and inter-species interactions in microbial communities. Frontiers in Microbiology. , e629 (2014).
- Siddiqui, R., Khan, N. A. Acanthamoeba is an evolutionary ancestor of macrophages: a myth or reality?. Experimental Parasitology. 130, 95-97 (2012).
- Khan, N. A. . Acanthamoeba: Biology and Pathogenesis. , (2014).
- Steenbergen, J. N., Casadevall, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection. 5, 667-675 (2003).
- Casadevall, A., Perfect, J. R. . Cryptococcus Neoformans. , (1998).
- Axelsson-Olsson, D., Olofsson, J., Ellstrom, P., Waldenstrom, J., Olsen, B. A simple method for long term storage of Acanthamoeba species. Parasitology Research. 104, 935-937 (2009).
- Sebolai, O. M., et al. 3-Hydroxy fatty acids found in capsules of Cryptococcus neoformans. Canadian Journal of Microbiology. 53, 809-812 (2007).
- Sebolai, O. M., Pohl, C. H., Botes, P. J., van Wyk, P. W. J., Kock, J. L. F. The influence of acetylsalicylic acid on oxylipin migration in Cryptococcusneoformans var. neoformans UOFS Y-1378. Canadian Journal of Microbiology. 54, 91-96 (2008).
- Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000 Research. , e6435.1 (2015).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing – multiscale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. Journal of Cell Science. 130, 23-38 (2017).
- Lewis, L. E., Bain, J. M., Okai, B., Gow, N. A. R., Erwig, L. P. Live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. , e50196 (2013).
- Duane, E. G. A practical guide to implementing a BLS-2+ biosafety program in a research laboratory. Applied Biosafety. 18, 30-36 (2013).
- Madu, U. L., et al. Cryptococcal 3-hydroxy fatty acids protect cells against amoebal phagocytosis. Frontiers in Microbiology. , e1351 (2015).
- Smith, D., Onions, A. H. S. . The Preservation and Maintenance of Living Fungi: IMI Technical Handbooks No. 2. , (1994).
- Schuster, F. L. Cultivation of pathogenic and opportunistic free-living amebas. Clinical Microbiology Reviews. 15, 342-344 (2002).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21, 1-2 (2001).
- Beisker, W., Bolbeare, F., Gray, J. W. An improved immunocytochemical procedure for high sensitivity dectection of incorporated bromodeoxyuridine. Cytometry. 8, 235-239 (1987).
- Clancy, B., Cauller, L. J. Reduction of background autofluorescence in brain sections following immersion in sodium borohydride. Journal of Neuroscience Methods. 83, 97-102 (1998).
- Simons, E. R. Measurement of phagocytosis and of phagosomal environment in polymorphonuclear phagocytes by flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , (2010).
- Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. Ratiometric Imaging of pH Probes. MethodsinCellBiology. 123, 429-448 (2014).
- van Wyk, P. W. J., Wingfield, M. J. Ascospores ultrastructure and development in Ophiostoma cucullatum. Mycologia. 83, 698-707 (1991).
- Spur, A. R. A low viscosity epoxy resin embedding medium for electron microscopy. Ultrastructural Research. 26, 31-43 (1969).
- Department of Minerals and Energy. . Radioactive Waste Management Policy and Strategy for the Republic of South Africa. , (2005).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Cell Biology. 17, 208-212 (1963).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 5th edition. , (2001).
- Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Current Biology. 16, 2156-2160 (2006).
- Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcusneoformans phagocytosis by macrophages. Current Biology. 16, 2161-2165 (2006).
- Madu, U. L., Ogundeji, A. O., Pohl, C. H., Albertyn, J., Sebolai, O. M. Elucidation of the role of 3-hydroxy fatty acids in Cryptococcus-amoeba interactions. Frontiers in Microbiology. , e765 (2017).
- Hayes, B. K., Heit, E. . Inductive reasoning 2.0. , e1459 (2018).
- Meindl, C., Öhlinger, K., Ober, J., Roblegg, E., Fröhlich, E. Comparison of fluorescence-based methods to determine nanoparticle uptake by phagocytes and non-phagocytic cells in vitro. Toxicology. 378, 25-36 (2017).
