Оценка взаимодействия между дополнением белка C1q и гиалуроновой кислоты в содействии клеточной адгезии
Summary
Дополнительным компонентом C1q является провоспалительная молекула, высоко выраженная в микроокружении тканей, которая может взаимодействовать с внеклеточной матрицей. Здесь мы описываем метод, чтобы проверить, как C1q связаны с гиалуроновой кислотой влияет на сливки клеток.
Abstract
Все чаще становится очевидным, что микроокружение опухоли играет активную роль в росте неоплазии и метастазах. Через различные пути, опухолевые клетки могут эффективно набирать стромальные, иммунные и эндотелиальные клетки путем выделения стимулирующих факторов, хемокины и цитокины. В свою очередь, эти клетки могут изменять сигнальные свойства микросреды, высвобождая стимулирующие рост сигналы, метаболиты и внеклеточные матричные компоненты для поддержания высокой пролиферации и метастатического свойства. В этом контексте мы определяем, что компонент C1q, высоко выраженный локально рядом злокачественных опухолей человека, при взаимодействии с внеклеточной матричной гиалуроновой кислотой, сильно влияет на поведение первичных клеток, изолированных от опухоли человека Образцов. Здесь мы описываем метод проверки того, как C1q, связанный с гиалуроновой кислотой (HA), воздействует на сливные клетки опухоли, лежащие в основе того факта, что биологические свойства ключевых компонентов внеклеточной матрицы (в данном случае HA) могут быть сформированы биоактивными сигналами к опухоли Прогрессии.
Introduction
Микросреда опухоли (TME) влияет на развитие рака и прогрессирование, поскольку она может обеспечить вседозволенную нишу для выживания клеток, роста и вторжения. Выявление новых ключевых игроков в ТМЕ может быть полезным для открытия новых молекулярных инструментов для целевой терапии. TME включает в себя сложную и динамичную сеть незлокачественных клеток, таких как эндотелиальные клетки, фибробласты и клетки иммунной системы, встроенные в окружающие внеклеточные матеновые компоненты (ECM), включая коллагены, ламинины, фибронектины, протеогликанов и гиалуронов. Как опухолевые, так и неопухолевые клетки синтезируют и выделяют компоненты ECM вместе с цитокинами, хемокинами, факторами роста и воспалительными и матричными ремоделирования ферментов, которые в целом изменяют физические, химические и сигнальные свойства TME. Среди этих компонентов, гиалуроновая кислота (HA) возникла оказывать решающую роль в биологии опухоли. Несмотря на свой простой химический состав, HA, вместе с его HA-связывающих молекул (гиаладеринов), может модулировать ангиогенез, иммунная система отзывчивость и ECM ремоделирования в размере и концентрации зависимым образом1.
Система дополнения (С) также является частью местной ТМЭ, которой в последнее время уделяется все большее внимание. Система C включает в себя набор растворимых и мембранных белков, участвующих в первой линии защиты от не-самоклеток, нежелательных элементов хозяина и патогенных микроорганизмов. Функционально, C связывает двух-эффектор оружия врожденных и адаптивных систем для содействия либо прямого убийства клеток или монтажа воспалительных ответ2. C активация может подавить рост опухоли, путем уничтожения раковых клеток или ингибирования их роста, но становится все более очевидным, что он может обладать опухолевых поощрения деятельности путем поддержания хронического воспаления, способствуя созданию иммуносупрессивной среде, вызывая ангиогенез, и активации рака связанных сигнальных путей3. В этом контексте, C1q, первая молекула распознавания классического пути системы C появился для оказания важных функций в микросреде опухоли независимо от активации C4. C1q было показано, что выражается локально целый ряд человеческих злокачественных опухолей, где он может способствовать раковой клетки адгезии, миграции и распространения в дополнение к ангиогенеза и метастазов5. Интересно, что C1q взаимодействует с основным компонентом ECM, таким как HA.
Мы разработали метод изолировать первичные раковые клетки от опухолевой массы. Кроме того, мы создали матрицу, которая может стимулировать микроокружение опухоли, в частности взаимодействие между C1q и высокомолекулярной гиалуроновой кислотой. C1q связаны с HA удалось вызвать сливку опухолевых клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем простой метод для исследования того, как компонент дополнения C1q, взаимодействующий с гиалуроновой кислотой, способен модулировать поведение первичных клеток, изолированных от тканей опухоли человека. Оба HA и C1q обильно присутствуют в микросреде ткани как в физиологическ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ивана Донати за предоставление HA, Леонардо Амадио, Габриэлла Зито (Департамент гинекологии IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Италия) и Андреа Романо (Оперативное клиническое отделение анатомии и патологической гистологии, Больница Каттинара, Триест, Италия ) для сбора образцов тканей. Мы благодарим также Николо Морозини за помощь в подготовке видео и Алекс Коппола, голос. Эта работа была поддержана грантами от Института охраны здоровья матери и ребенка, IRCCS “Burlo Garofolo”, Trieste, Италия (RC20/16) и Fondazione Cassa di Risparmio Trieste к R.Bulla.
Materials
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
