تقييم التفاعل بين بروتين C1Q وحمض الهيالورونيكس في تعزيز التصاق الخلايا
Summary
مكون تكملة C1q هو جزيء الموالية للالتهابات أعرب بشدة في الأنسجة microenvironment التي يمكن أن تتفاعل مع مصفوفة خارج الخلية. هنا، ونحن نوصف طريقة لاختبار كيف C1Q ملزمة لحمض الهيالورونيكس يؤثر التصاق الخلية.
Abstract
وقد ثبت بشكل متزايد أن البيئة الدقيقة الورم يلعب دورا نشطا في نمو الورم والانبثاث. من خلال مسارات مختلفة، يمكن للخلايا السرطانية تجنيد الخلايا الجذعية والمناعية والبطانية بكفاءة عن طريق إفراز العوامل المحفزة، والكيماويات والسيتوكينات. بدوره، يمكن لهذه الخلايا تغيير خصائص الإشارات للبيئة الدقيقة عن طريق الإفراج عن إشارات تعزيز النمو، المستقلبات ومكونات المصفوفة خارج الخلية للحفاظ على الانتشار العالي والكفاءة النقيلية. في هذا السياق، نحدد أن مكون تكملة C1q، الذي يعبر عنه محلياً مجموعة من الأورام الخبيثة البشرية، عند التفاعل مع حمض الهيالورونيكس المصفوفة خارج الخلية، يؤثر بشدة على سلوك الخلايا الأولية المعزولة عن الورم البشري العينات. هنا، ونحن نوصف طريقة لاختبار كيف C1q ملزمة حمض الهيالورونيكس (HA) يؤثر على التصاق الخلايا السرطانية، الكامنة وراء حقيقة أن الخصائص البيولوجية للمكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (في هذه الحالة HA) يمكن أن تشكل ها بإشارات نشطة بيولوجيا نحو الورم التقدم.
Introduction
تؤثر البيئة الصغرية للورم (TME) على تطور السرطان وتطوره لأنه يمكن أن يوفر مكانة متساهلة لبقاء الخلايا ونموها وغزوها. قد يكون تحديد اللاعبين الرئيسيين الجدد في TME مفيدًا لاكتشاف أدوات جزيئية جديدة للعلاج المستهدف. TME يتضمن شبكة معقدة وديناميكية من الخلايا غير الخبيثة، مثل الخلايا البطانية، الخلايا الليفية وخلايا الجهاز المناعي، جزءا لا يتجزأ من مكونات المصفوفة خارج الخلية المحيطة (ECM) بما في ذلك الكولاجين، laminins، فيبرونيكتينس، البروتيوغليكانوهيون وهيالورونان. كل من الخلايا الورم ية وغير الورم توليف وإفراز مكونات ECM جنبا إلى جنب مع السيتوكينات, chemokines, عوامل النمو والالتهابات ومصفوفة إعادة عرض الإنزيمات التي تغير عموما الخصائص الفيزيائية, الكيميائية والإشارة من TME. ومن بين هذه المكونات، ظهر حمض الهيالورونيكس (HA) لممارسة دور حاسم في علم الأحياء الورم. على الرغم من تركيبتها الكيميائية البسيطة، يمكن ها، جنبا إلى جنب مع جزيئاتها ملزمة HA (hyaladherins)، تعديل الأوعية، واستجابة الجهاز المناعي وإعادة عرض ECM في حجم والتركيز طريقة تعتمد1.
كما أن نظام التكملة (جيم) هو أيضاً جزء من النظام المحلي للإدارة التكميلية، الذي حظي مؤخراً باهتمام متزايد. ويشمل نظام C مجموعة من البروتينات القابلة للذوبان والأغشية المرتبطة المشاركة في خط الدفاع الأول ضد الخلايا غير الذاتية والعناصر المضيفة غير المرغوب فيها ومسببات الأمراض. وظيفيا، وC يربط الأسلحة ذات تأثيرين من النظم الفطرية والتكيفية لتعزيز إما القتل المباشر للخلايا أو تصاعد استجابة التهابية2. يمكن تفعيل C قمع نمو الورم، عن طريق تدمير الخلايا السرطانية أو تثبيط نموها، ولكن أصبح من الواضح بشكل متزايد أنه يمكن أن تمتلك نشاط تعزيز الورم من خلال الحفاظ على التهاب مزمن، وتعزيز إنشاء وسط كبت المناعة، مما يحفز توليد الأوعية، وتفعيل مسارات الإشارات المتعلقة بالسرطان3. في هذا السياق، C1q، وقد ظهرت أول جزيء الاعتراف من المسار الكلاسيكي للنظام C لممارسة وظائف هامة في microenvironment الورم بشكل مستقل عن C تفعيل4. وقد تبين أن C1q يتم التعبير عنها محليا من قبل مجموعة من الأورام الخبيثة البشرية، حيث يمكن أن تفضل التصاق الخلايا السرطانية والهجرة والانتشار بالإضافة إلى تكوين الأوعية والانبثاث5. ومن المثير للاهتمام C1q يتفاعل مع أحد المكونات الرئيسية لـ ECM مثل HA.
لقد طورنا تقنية لعزل الخلايا السرطانية الأولية عن كتلة الورم. وعلاوة على ذلك، أنشأنا المصفوفة، والتي يمكن أن تحفز الورم microenvironment، وخاصة التفاعل بين C1q وارتفاع حمض الهيالورونيكس الجزيئي. C1q ملزمة إلى HA كان قادرا على الحث على التصاق الخلايا السرطانية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تصف طريقة سهلة للتحقيق في كيفية تكملة مكون C1q، والتفاعل مع حمض الهيالورونيكس، قادرة على تعديل سلوك الخلايا الأولية المعزولة من أنسجة الورم البشري. كل من HA و C1q موجودة بوفرة في الأنسجة microenvironment سواء في ظل الظروف الفسيولوجية والمرضية، والمشاركة في العديد من العمليات البيولوجية الخلية. ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر إيفان دوناتي على توفيرها لـ HA وليوناردو أماديو وغابرييلا زيتو (قسم أمراض النساء في المركز الدولي للدراسات الجنائية في المركز الدولي للدراسات الجنائية في مدينة “بيرلو غاروفولو”، في تريستا، إيطاليا) وأندريا رومانو (وحدة العمليات السريرية لعلم التشريح وعلم الأنسجة المرضية، مستشفى كاتينارا، تريست، إيطاليا ) لجمع عينة الأنسجة. كما نشكر نيكولو موروسيني على المساعدة في إعداد الفيديو وأليكس كوبولا، الصوت. وقد دعم هذا العمل منح من معهد صحة الأم والطفل، ومؤسسة “بيرلو غاروفولو”، ومؤسسة ترييستي، إيطاليا (RC20/16)، ومؤسسة كاسا دي ريسابروميو تريستا إلى ر. بولا.
Materials
| 100 µm pore filter | BD Falcon | 352360 | |
| Amphotericin B solution (fungizone) | Sigma-Aldrich | 1397-89-3 | |
| basic FGF | Immunological Sciences | GRF-15595 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C-4901 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochemical Corporation, DBA | MX1D12644 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| DNase I | Roche | 10 104 159 001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | |
| EGF | Immunological Sciences | GRF-10544 | |
| FAST DiI | Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | D7756 | |
| Fetal bovine serum | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Fibronectin | Roche | 11051407001 | |
| Flask for cell culture | Corning | 430639 | Sterile, vented |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397-10ML | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBBS) | Sigma-Aldrich | H6648 | Supplemented with EDTA, Glucose, penicillin-streptamicin, gentamicin and fungizone |
| High molecular weight hyaluronic acid | Kind gift by Prof. Ivan Donati | ||
| Human endothelial serum free medium | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11111-044 | Supplemented with EGF (5 ng/mL), basic FGF (10 ng/mL), and 1% penicillin–streptomycin (Sigma-Aldrich) |
| Magnesium Chloride | Carlo Erba | 13446-18-9 | |
| Medium 199 with Hank’s salt | Sigma-Aldrich | M7653 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Time-lapse microscopy | Nikon | Imaging System BioStation IM-Q | |
| Titertek Multiskan ELISA Reader | Flow Labs | ||
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4674 |
References
- Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function. Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).
- Lorusso, G., Ruegg, C. The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).
- Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).
- Bulla, R., et al. C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation. Nature Communications. 7, 10346 (2016).
- Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. Prognostic stromal gene signatures in breast cancer. Breast Cancer Research. 17, 23 (2015).
- Collins, M. N., Birkinshaw, C. Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification. Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).
- Itano, N. Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan. Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).
- Agostinis, C., et al. An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development. Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).
- Agostinis, C., et al. Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth. Frontiers in Immunology. 8, 1559 (2017).
- Bossi, F., et al. C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).
- Hosszu, K. K., et al. Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes. Frontiers in Immunology. 3, 38 (2012).
- Laurent, T. C., Fraser, J. R. Hyaluronan. Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).
- Gaboriaud, C., et al. The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties. Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).
- Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds. Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).
