Aquí, presentamos un protocolo para el ex vivo cualitativamente específica de antígeno CD8+ T las células. Análisis es posible con suspensiones de la célula de órganos o de pequeñas cantidades de sangre. Una amplia gama de estudios requieren el análisis de las respuestas de la célula de T citotóxica (vacunación y estudios de inmunoterapia del cáncer).
A infección viral, específica de antígeno CD8+ las células T citotóxicas (CTL) se presentan y contribuir a la eliminación de las células infectadas para prevenir la propagación de agentes patógenos. Por lo tanto, la frecuencia del antígeno específico CTLs es indicativa de la fuerza de la respuesta de células T contra un antígeno específico. Dicho análisis es importante en la inmunología básica, desarrollo de vacunas, Inmunobiología del cáncer y la inmunología adaptativa. En el campo de la vacuna, la respuesta CTL dirigida contra los componentes de un vector viral Co determina qué tan eficaz es la generación de células de antígeno-específico contra el antígeno de interés (es decir,, transgen). Antígeno específico CTLs pueden detectarse ya sea por estimulación con péptidos específicos seguidos por citoquinas intracelulares la coloración o tinción directa de los receptores específicos de antígeno de la célula de T (TCRs) y análisis por citometría de flujo. El primer método es bastante lento ya que requiere el sacrificio de animales para aislar células de órganos. Además, requiere aislamiento de sangre de animales pequeños que es difícil de realizar. Este último método es más rápido, puede hacerse fácilmente con pequeñas cantidades de sangre y no es dependiente en las funciones efectoras específicas, como la actividad citolítica. Tetrámeros de MHC son una herramienta ideal para la detección específica de antígeno TCR.
Aquí, describimos un protocolo para detectar simultáneamente antígeno específico CTLs para los péptidos inmunodominante del vector viral VSV-GP (GP de LCMV, VSV-NP) y los transgenes (OVA, VPH 16 E7, eGFP) por MHC I tetrámero coloración y flujo cytometry. La coloración es posible directamente de la sangre o de suspensiones celulares solo de órganos, como bazo. Sangre o suspensiones de la célula de órganos se incuban con tetrámeros. Después de la tinción con los anticuerpos CD3 y CD8, antígeno específico CTLs se cuantifican mediante citometría de flujo. Opcionalmente, se puede incluidos para determinar el estado de activación de CD8 específica de antígeno anticuerpos contra CD43, CD44, CD62L u otros+T las células y para discriminar entre ingenuo y efectoras de las células.
El objetivo de este método es evaluar la frecuencia de respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL) a los antígenos (múltiples) en el ratón mediante el análisis cytometric del flujo sin necesidad de estimulación péptido desperdiciador de tiempo. Este método analiza la especificidad de antígeno y el fenotipo de subconjuntos CTL, en una única coloración. Hemos optimizado el complejo de histocompatibilidad mayor I (MHC I) tetrámero protocolo para analizar la eficacia de los nuevos enfoques de la vacuna, como VSV-GP, una nueva variante de virus de estomatitis vesicular (VSV), donde la glicoproteína G de VSV se ha sustituido por la coloración la glicoproteína GP del linfocítico choriomeningitis virus (LCMV)1,2. Además de la respuesta humoral, un importante indicador de la efectividad de una vacuna es la inducción de una respuesta CTL contra uno o varios antígenos. Como la consistencia y durabilidad de la respuesta celular están importantes en este contexto, es favorable para monitorizar la cinética de las respuestas CTL del mismo animal. Esto también conducirá a una reducción del número de animales, un aspecto importante con respecto a los principios de las “3Rs”3. Por lo tanto, análisis de tan poco como 20 μl de sangre es óptima para este propósito.
Tetrámeros fueron desarrollados a finales de los 904 y se convirtió en una herramienta importante en el campo de la inmunología de la célula de T. Tetrámeros son complejos marcada con fluorescencia de cuatro MHC I / moléculas péptido, que se unen a TCR, específico para un solo péptido. Hoy en día, se pueden ya comprar confeccionado5, pedido personalizado de forma gratuita en las instalaciones de base tetrámero de NIH en la Universidad de Emory6 o producidos en el laboratorio7. MHC y tetrámeros II están disponibles, , es decir, para CD8+ y CD4+ T de las células, respectivamente. La potencia de la tinción de tetrámero se encuentra en ahorro de tiempo, algo simple y fácil de estandarizar protocolos de8 y9de la sensibilidad. Además, si trabaja con sangre, animales no necesita ser sacrificado y se requieren cantidades mínimas de muestra. Una medición no se limita a un solo antígeno, pero pueden analizarse varios antígenos en una coloración cuando la combinación de tetrámeros conjugado con diferentes fluoróforos. Antígenos recién descubiertos, por ejemplo, de pantallas de péptido, fácilmente pueden incorporados en tetrámeros y utilizados para la cuantificación del subconjunto de células T.
La tinción de tetrámero no dará información sobre la funcionalidad CTL (es decir., producción de citoquinas, funciones efectoras), pero sólo de especificidad. Para obtener información sobre funcionalidad de la célula de T, citoquinas intracelulares (ICS) la coloración o necesidades análisis de enzima vinculada inmuno Spot (ELISpot) que realizó8,10. La tinción de tetrámero y ICS/biológico, sin embargo, no son redundantes pero más bien complementan. Estimulación in vitro para inducir la producción de citoquinas para ICS/extrapolación alterará el fenotipo de célula T original. Tetrámero de tinción, por el contrario, deja la célula T Virgen; el fenotipo original se conserva y puede ser analizado. También, otra gran ventaja de tetrámeros es que la coloración puede combinarse con clasificación magnética y enriquecimiento de las células antígeno específicas11. Esto permite el análisis de raras poblaciones, así como cultivo de células clasificadas con antígeno-especificidades definidas — una característica que no es posible con otros métodos.
Utilizando el protocolo descrito aquí, la tinción de tetrámero, así como ICS/extrapolación se puede realizar de un órgano, porque solamente muy poco material (sangre: 20 μl; bazo: 1 x 106 células) se requiere para la tinción de tetrámero. Sin embargo, dependiendo de la frecuencia de las células antígeno específicas de interés, la fuerza del TCR respectivo y en el contexto experimental, la cantidad de células necesarias deba ampliarse o enriquecimiento magnético que deba aplicarse.
Tetrámeros son ampliamente utilizados, por ejemplo, para evaluar la efectividad de las vacunas (antitumoral)12,13,14,15 o inmunoterapia16,17, análisis fenotípico y espacial localización de la célula de T antígeno-específica subconjuntos18,19,20,21,22,23. El método descrito aquí es ideal para estudios, que tienen como objetivo incluir la cuantificación y análisis fenotípico de murino específico antígeno CD8+ T las células en su análisis de manera rápida y conveniente.
La tinción de tetrámero es un protocolo bastante simple y sencillo para analizar el fenotipo y el péptido de especificidad de un linfocito T. El uso de sangre para análisis, como se describe aquí, es mínimamente invasivo y permite el control continuo, por ejemplo en estudios de vacunación. En el campo de la vacunación, la cuantificación de las respuestas de vector y antígeno específico es de interés, como respuestas específicas de vectores puedan interferir con una respuesta inmune efectiva contra el antígeno de vacuna28. Es de destacar que con el protocolo descrito aquí, ambas poblaciones pueden cuantificarse simultáneamente en una tinción de tetrámero simple, reduciendo la variabilidad de coloración y las cantidades de muestra. Sin embargo, a pocos pasos deben hacerse cuidadosamente para asegurar la adecuada medición y datos fiables. Si con sangre de la vena de la cola para el análisis, uno debe asegurarse precalentar los animales para inducir vasodilatación24. Por lo tanto, suficiente sangre se puede recoger en poco tiempo, se reduce el estrés en los animales y el análisis es mucho mejor, en comparación a si se recoge la sangre lentamente. También, después de la recolección de la muestra (ya sea de sangre o de órganos), la coloración directa se recomienda para evitar resultados falsos negativos debido al downregulation del TCR. Lo mismo se aplica para todos los pasos posteriores: el procedimiento no debe ser interrumpido y todos los pasos de lavado reducción el número mínimo (como se ha dicho en el protocolo). Para asegurar la coloración correcta, debe tener cuidado al vórtice todas las soluciones y muestras antes y después de la incubación. Esto es especialmente importante antes de fijar las muestras para evitar la aglutinación de las células.
En términos de modificar el protocolo, otros marcadores de superficie y tetrámeros pueden utilizarse, dependiendo de la finalidad del análisis. Sin embargo, todos los reactivos deben titularse, óptimo en combinación con todo el panel de la coloración. Para algunos de los tetrámeros especificados aquí, optimización reveló que podemos aumentar la dilución recomendada por el fabricante (1:10 recomendado, optimizado 1:25) (tabla 1). Para compensar el solapamiento espectral, cuentas de compensación se pueden utilizar en lugar de células. Sobre la elección del fluorocromo tetrámero junto, uno debe prever para usar fluorocromos brillantes, como esto facilita la detección – especialmente cuando la señal es baja. Como Dolton y colaboradores29, preferimos utilizar tetrámeros junto PE o APC, que se pueden combinar perfectamente en una coloración única y CD8+ T las células con una especificidad de antígeno único pueden ser bien detectada (figura 2). En cuanto a tiempos de incubación y temperatura, existe una gran variedad de condiciones de tinción tetrámero. En nuestro proceso de optimización, abordó este tema y realiza tetrámero tinción en diferentes condiciones (por ejemplo 4 º C, temperatura ambiente o 37 ° C). De los resultados obtenidos, recomendamos a la mancha por 20 min a 37 ° C, que está en concordancia con la literatura30,31. Incubación prolongada debe evitarse, como esto puede llevar a la internalización de los resultados negativos de la30 y falso del tetrámero.
La elección del anticuerpo adecuado para la detección de CD8+ células es otra cuestión importante, que tiene cuidadosamente considerado (y potencialmente adaptado). Esto surge del hecho de que ciertos anticuerpos anti-CD8 clona bloque Unión de tetrámeros a TCR, en humano32 así como ratón33 muestras. Seleccionamos para nuestro protocolo de tinción de tetrámero, clon 53 – 6.7 a mancha para CD8 murino+ las células, un clon que no bloquea, pero algo mejora la tinción de tetrámero.
La tinción de tetrámero es algo sencilla al analizar inmunorespuestas prominente en el pico de la respuesta de la célula de T, por ejemplo. Sin embargo, puede haber poblaciones que son un poco más ‘problemáticas’. Tales ejemplos incluyen células específicas para antígenos de baja afinidad (tumor, uno mismo), recientemente activados las células que posteriormente regula sus receptores o subconjuntos raros de la célula (por ejemplo. ingenuo precursor o memoria celular poblaciones). En estos casos, el tetrámero clásico protocolo de tinción puede ser que necesite ser mejorado o combinado con otros métodos. Por ejemplo, el proteína quinasa inhibidor (PKI) dasatinib inhibe la internalización de TCR y podría incluirse antes de la tinción de tetrámero. Tetrámeros también pueden ser estabilizados por incluyendo el fluorocromo no conjugada Abs primaria después de la tinción de tetrámero. Además, la intensidad de fluorescencia puede incrementarse por la adición de un segundo anti-Ab conjugado con fluorocromo Ab29,34,35,36. Optimizado las condiciones selectivamente de los tetrámeros especificados en el presente Protocolo y no incluye PKI o Abs adicional. Sin embargo, para cualquier otro tetrámero, las condiciones óptimas deben ajustarse individualmente. Con respecto a las poblaciones de raras, la tinción de tetrámero que deba combinarse con enriquecimiento magnética11.
Para facilitar y validar el análisis FACS de la tinción de tetrámero, deben incluirse los controles positivos y negativos. Como control negativo, siempre se tiñen las células de un ratón de ingenua de la misma cepa con nuestro tetrámero de interés. Alternativamente, las muestras pueden teñirse con tetrámeros con péptidos irrelevantes, pero con el mismo fluorocromo como el tetrámero de interés. Dichos controles son esenciales para excluir falsas señales positivas, por ejemplo., origina de las células muertas. Además de esto, se recomienda incluir una mancha vivo o muertos, como el yoduro de propidio (PI). Esto es de especial importancia si las células no se tiñen directamente después del aislamiento. Otra estrategia para eliminar fondo de Autofluorescencia puede incluir varios marcadores de células no T en un canal. Excluyendo las células positivas en este canal, se pueden excluir las poblaciones T de la célula. Como control positivo, una muestra de un ratón de OT-1 puede utilizarse para el tetrámero de óvulos, por ejemplo. Para otros tetrámeros, esto tiene que ser elegido individualmente (por ejemplo., muestra de un ratón, que fue vacunado varias veces). Tanto otros37, también observamos una abajo-regulación del receptor CD8 durante la activación de CTL en el dia 7 del efector respuesta T celular. Por lo tanto, para evitar la pérdida de células efectoras T de tetrámero activado+ , recomendamos incluir las célulasbajo CD8 en el análisis (al menos si se mide en la fase efectora).
La calidad y cantidad de información que uno puede recuperar de este protocolo depende de los conocimientos acerca de los antígenos a estudiar, la disponibilidad y especificidad de tetrámero y la calidad de la máquina de FACS (número de láseres y detectores disponibles). Si se trabaja con muestras de animales, variación en la respuesta inmune es natural e inevitable. Por lo tanto, para obtener resultados significativos de la tinción de tetrámero, deben analizarse por lo menos 3 a 5 animales. Si lo ha hecho, el protocolo que se describe aquí dará resultados confiables y reproducibles (ejemplar resultado de un experimento puede encontrarse en la Tabla adicional 1). Como se mencionó anteriormente, este método se adapta perfectamente a cuantificar el fenotipo y la especificidad del antígeno de CD8+ T las células (figura 3, 4; Figura 1complementaria), no sólo en el ratón sino también en los seres humanos. Sin embargo, para analizar CD8+ células T efectoras las funciones, tales como la muerte celular inducida por la granzima, ICS o ápex deba realizarse. Sin embargo, se debe tener en cuenta que las funciones de la célula de T, medida por estimulación in vitro podrían no representar la situación real en vivo. In vivo, un ambiente represivo podría impedir las funciones de la célula de T que se miden en vitro.
En su el propios, tetrámero tinción no proporciona toda la información, sino evolucionó para convertirse en un método esencial para caracterizar las respuestas de células T y cuantificar subconjuntos de células T in vitro en una manera muy sensible38. Tetrámeros no pueden utilizarse para cuantificar determinados subconjuntos, sino también para aislar a los39, localizar por hibridación in situ19,20 y estudio de antígenos de baja afinidad, tales como tumor-associated40, 41. desde el descubrimiento del tetrámero tecnología4, la tinción de tetrámero se ha convertido en una herramienta esencial en el análisis de células T y la gama de aplicaciones.
The authors have nothing to disclose.
Este proyecto fue financiado por el fondo de la ciencia austríaca FWF (proyecto número P 25499-B13) y de la Unión Europea horizonte 2020 programa de investigación e innovación en conceden acuerdo no. 681032. El siguiente reactivo se obtuvo a través de la instalación de base de tetrámero de NIH: clase I MHC Tetramer de la nucleoproteína del virus de la estomatitis vesicular (RGYVYQGL).
Safety cabinet class 2 | VWR | LBCP302411030 | |
Flow cytometer (e.g. FACSCanto II) | BD | 338962 | |
Analysis platform for flow cytometry analysis (e.g. FlowJo) | Fisher Scientific Co. L.L.C. | NC0887833 | |
Binocular microscopes, VisiScope 100 | VWR | 630-1553 | |
Vortex mixer | Phoenix Instrument | RS-VA 10 | |
Centrifuge suitable for FACS tubes (e.g. Rotanta 460R) | Hettich | 5660 | |
Sterile Scalpel Blades Nr. 10 | Braun | BB510 | |
Cell strainer 40 µm | Sigma | CLS431750 | |
Cell strainer 70 µm | Sigma | CLS431751 | |
Neubauer counting chamber | VWR | 630-1506 | |
Pipettes (20 μL, 200 µL and 1000 μL) | Eppendorf | 4924000037, 4924000061, 4924000088 | |
Pipette tips, sterile (20 µL, 200 µL, 1000 µL) | Biozym | 770050, 770200, 770400 | |
Pipet Boy | Integra | 155 000 | |
Sterile pipettes (5 mL, 10 mL, 25 mL) | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
Multistep Pipette, HandyStep S | BRAND | 705110 | |
12.5 ml Combitips for Multistep Pipette | BrandTech Scientific | 702378 | |
Microvette CB 300 K2E | Sarstedt | 16.444 | |
Sterile reaction tubes (1.5 mL, 50 mL) | Sarstedt | 72.692.005, 62.547.254 | |
FACS tubes (non-sterile) | Szabo Scandic | BDL352008 | |
PBS | Lonza | LONBE17-516F | |
Heat-inactivated FCS | ThermoFisher Scientific | 10500064 | |
Formaldehyde | Roth | 4979.1 | |
Sodium azide | Roth | K305.1 | |
PE-Cy7 Rat Anti-Mouse CD3 Molecular Complex | BD | 560591 | Clone 17A2; Lot # 7235504 |
Pacific Blu Rat Anti-Mouse CD8a | BD | 558106 | Clone 53-6.7; Lot # 5058904 |
V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD | 560469 | Clone 53-6.7; Lot # 5205945 |
FITC anti-mouse CD43 | BioLegend | 121206 | Clone 1B11; Lot # B233778 |
PE-Cy5 Rat Anti-Mouse CD44 | BD | 553135 | Clone IM7; Lot # 85660 |
APC-Cy7 Rat Anti-Mouse CD62L | BD | 560514 | Clone MEL-14; Lot # 7215801 |
OVA-tetramer/APC | MBL | TB-5001-2 | SIINFEKL, H-2Kb; Lot # T1702008 |
VSV NP-tetramer/PE | MBL | TS-M529-1 | RGYVYQGL, H-2Kb; Lot # 007 |
EGFP-tetramer/PE | MBL | TS-M525-1 | HYLSTQSAL, H-2Kd; Lot # 004 |
LCMV-GP-tetramer/APC | MBL | TB-5002-2 | KAVYNFATC, H-2Db; Lot # T1412006 |
HPV 16 E7-tetramer/APC | MBL | TB-5008-2 | RAHYNIVTF, H-2Db; Lot # T1804003 |