Protein Halifeliğin bağırsak iltihabı bir iltihabi bağırsak hastalığı fare modeli üzerinde sinyal tat etkileri
Summary
Burada dextran sülfat sodyum (DSS) bağışıklık yanıtı düşmesi tadına bakma ilgili genlerin etkisini araştırmak için bir protokol mevcut-inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) fare modeli indüklenen.
Abstract
İltihabi bağırsak hastalığı (IBD) ülseratif kolit ve Crohn hastalığı, dünyanın her yerinden insanlar milyonlarca yaşam kalitesini etkileyen dahil bağışıklık ile ilgili gastrointestinal bozukluklar biridir. IBD belirtileri karın ağrısı, ishal ve rektal kanama, hangi gut microbiota, gıda bileşenleri, Bağırsak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler neden olabilir içerir. Bağırsak epitel ve bağışıklık hücreleri ifade her anahtar gen kolon iltihabı nasıl etkileyeceğini değerlendirmek için önem taşımaktadır. G protein birleştiğinde tat reseptörleri G protein alt birimi α-gustducin ve sinyal diğer proteinler de dahil olmak üzere, bağırsaklarında bulduk. Burada, bir temsilcisi olarak α-gustducin kullanırız ve dextran sülfat sodyum (DSS) tarif-tat gen mutasyonlarının gut mukozal bağışıklık ve iltihap üzerindeki etkisini değerlendirmek için IBD modeli indüklenen. Bu yöntem gen nakavt teknoloji kimyasal olarak indüklenen IBD modeli ile birleştirir ve böylece yanı sıra exuberate ya da kolon DSS kaynaklı bağışıklık yanıtı nemlendirin diğer genler tat gen düşmesi sonucu değerlendirmek için uygulanabilir. Mutasyona uğramış fareler DSS ile hangi sırasında kendi vücut ağırlığı, dışkı ve rektal kanama izlenen kaydedildi ve belirli bir süre için uygulanmaktadır. Yönetimi sırasında farklı timepoints are euthanized bazı fareler, daha sonra boyutları ve ağırlıkları dalağı ve iki nokta üst üste ölçülür ve gut doku toplanan ve için işlenen histolojik ve gen ifade analizleri. Verileri bu aşırı kilo kaybı, ishal, bağırsak kanaması, doku hasarı ve iltihap vs. wild-tipi fareler α-gustducin nakavt sonuçları göster. İndüklenen enflamasyonu şiddeti fare suşları, konut çevre ve diyet tarafından etkilenir, DSS konsantrasyon ve yönetim süresi bir pilot deneyinde duruma getirilmesi özellikle önemlidir. Bu faktörler ayarlayarak, bu yöntem her iki anti – ve pro-inflamatuar etkileri değerlendirmek için uygulanabilir.
Introduction
İltihabi bağırsak hastalığı (IBD), Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) iki ana türde koşullarından kronik remittent ya da ilerici inflamatuar bağırsak multifaktöriyel etyoloji1,2 ile karakterizedir . IBD gelişimi diyet, antibiyotik kullanımı, genetik gibi belirli çevresel faktörlere bağlıdır ve önemlisi, patojenik enfeksiyonlar. Ancak, etyoloji ve IBD temel yasal moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal olarak indüklenen IBD hayvan modelleri inşa edilmiş ve patogenez ve düzenleyici mekanizmaları betimlemek ve insan tedavi3etkinliğini değerlendirmek için uygulanan.
Tat reseptörleri G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır ve iki önemli türü sınıflandırılır: tip ı (T1Rs) ve tatlı, umami ve acı bileşikleri algılayan II (T2Rs) yazın. Tat sinyal cascades tastant T1Rs veya T2Rs, heterotrimeric aktive α-gustducin ve Gβγ dimer oluşan ve Gβγ alt birimleri serbest bırakmak için önde gelen G protein bağlama tarafından başlatılır. Gβγ yan sırayla aşağı akım efektör enzim Fosfolifaz C-B2 (PLC-B2) uyarır. Aktif PLC-B2 sonra iki hücre içi ikincil haberci [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol] ve IP3 bağlanır içine phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate dag ve kanal-reseptör IP3 açmak R3, endoplazmik retikulum gelen kalsiyum iyonları serbest. Bu sonunda geçici reseptör potansiyel iyon kanal Trpm5 açılması ve serbest bırakmak-in nörotransmitter ATP tat sinirler4,5,6,7üzerine yol açar. Ancak, farklı ve bağımsız sinyal yollar tuzlu ve ekşi tadı tatlı, umami ve acı tadı8vardır. Buna ek olarak, tat GPCRs bileşenleri ve aşağı akım proteinler çeşitli ekstra oral dokularda mevcut. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu α-gustducin belirtilen, tat sinyal, asıl bileşen bulunan bağırsak mukoza ifade edilecek. Daha fazla çalışmaları ekstra oral doku9,10bileşenlerinde sinyal bu tadı işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada açıklanan yöntemi tat sinyal proteinlerin ekstra oral dokularda işlevleri tanımlamak için kullanılır. Biz kimyasal olarak bağlı kolit modeli ile damak tadınızı sinyal Cascade’lerde operasyona için geliştirilen bir transgenik fare çizgi birleştirmek. Yordam sadeliği ve insan ülseratif kolit patolojik benzerlikler nedeniyle büyük ölçüde, dextran (DSS) sodyum sülfat-indüklenen IBD modeli en yaygın olarak kullanılan çeşitli kimyasal olarak bağlı kolit modelleri11arasında. Bu çalışmada, α-gustducin-eksik fareler bir temsilcisi fare çizgi olarak α-gustducin roman fonksiyonları gut mukozal bağışıklık ve iltihap 1) morfolojik değişiklikler doku analiz ve 2) raporlaması ifade farklılıkları ortaya çıkarmak için kullandığımız sitokinler kolon iltihabı ile ilgili. Bu yöntem genler için genetik olarak değiştirilmiş fare hatları ne zaman nicelik ve nitelik tat sinyal proteinleri (ve diğer proteinlerin gut) doku hasarı ve bağırsak iltihabı, belirlemek için kullanılabilir faiz mevcuttur. Bu yöntemin avantajları, olanaklı kılmak kullanıcı-eylemleri hem kimyasal DSS ve gen ilgi eksikliği kaynaklanan entegre verileri elde etmek. Bu yöntem, hassasiyeti artırmak ve ince bağırsak değişiklikler, hücresel ve moleküler düzeyde ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem quantitively için istihdam edilecek özel tat gen mutasyonlar etkisi iltihap DSS kaynaklı IBD fare modeli belirlemek. Tam olarak yararlanmak için en iyi indüksiyon IBD önemli bir adımdır. Kolit gelişimi fare zorlanma, konut çevre, barsak mikroflorası yanı sıra ilgi genler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından etkilenir. Bu fareler farklı dozlarda test etmek için az sayıda ve süreleri DSS yönetim ile bir pilot deneme gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Sırasında pilot den…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81671016, 31471008 ve 31661143030) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DC010012, DC015819) ve Siyuan Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -. H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -. G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -. C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), 1329-1333 (2016).
