선 동적인 장 질병 마우스 모델에서 창 자 염증 단백질 폐지를 신호 하는 맛의 효과
Summary
여기에 우리가 dextran 황산 나트륨 (DSS)에 면역 반응에 맛보기 관련 유전자의 무효의 효과 조사 하기 위해 프로토콜을 제시-선 동적인 장 질병 (IBD) 마우스 모델을 유도.
Abstract
선 동적인 장 질병 (IBD)는 면역-관련 위장 장애, 궤 양성 대 장 염 및 Crohn의 질병, 전세계 사람들의 수백만의 삶의 질에 영향을 주는 등 중 하나입니다. IBD 증상 복 통, 설사, 직장 출혈, 본질적인 microbiota, 음식 구성 요소, 장 상피 세포, 면역 세포 간의 상호 작용에서 발생할 수 있습니다. 그것은 장 상피와 면역 세포에 표현 된 각 주요 유전자는 콜론에 염증에 미치는 영향을 평가 하기 위해 특별 한 중요성 의입니다. G 단백질 결합 맛 수용 체, G 단백질 소 단위 α-gustducin와 다른 신호 단백질을 포함 하 여 창 자에서 발견 되었습니다. 여기, 우리가 사용 하 여 α-gustducin 대표 dextran 황산 나트륨 (DSS) 설명-창 자 점 막 면역과 염증에 미각 유전자 돌연변이의 효과 평가 하 IBD 모델을 유도. 이 메서드는 화학적으로 유도 된 IBD 모델 유전자 녹아웃 기술을 결합 하 고 따라서 다른 유전자를 exuberate 수 있습니다 또는 콜론에 DSS 유도 된 면역 반응을 저해할 뿐 아니라 미각 유전자 무효의 결과 평가에 적용할 수 있습니다. 돌연변이 쥐를 일정 기간 동안 자신의 몸 무게의 자, 직장 출혈 모니터링 및 기록에 대 한 DSS와 함께 관리 됩니다. 관리 하는 동안 다른 timepoints에서 일부 마우스 안락사는, 크기 및 그들의 spleens와 콜론의 무게 측정 그리고 창 자 조직 수집 및 처리 조직학 및 유전자 표정 분석. 데이터는 과도 한 체중 감소, 설사, 장 출혈, 조직 손상 및 염증 대 야생-타입 마우스에 α-gustducin 녹아웃 결과 표시. 마우스 긴장, 주택 환경, 그리고 다이어트에 의해 유발된 염증의 심각도 영향을 DSS 농도 및 관리 기간 파일럿 실험의 최적화가 특히 중요 합니다. 이러한 요소를 조정 하 여 두 안티-과 프로-염증 성 효과 평가 하기 위해이 메서드를 적용할 수 있습니다.
Introduction
선 동적인 장 질병 (IBD), (CD), 크 론 병 및 궤 양성 대 장 염 (UC)의 두 가지 주요 형태는 multifactorial 병 인1,2 장의 만성 remittent 또는 진보적인 선 동적인 조건 특징 . IBD의 개발 다이어트, 항생제 사용, 같은 유전자로 특정 환경 요인에 따라 달라 집니다 중요 한 병원 성 감염. 그러나, 병 인 및 IBD 기본 규정 분자 메커니즘 여전히 명확 하지 않다. 따라서, 많은 화학적으로 유도 된 IBD 동물 모델이 건설 고 pathogenesis 및 규제 메커니즘 윤곽을 그리 다 고 인간 치료제3의 효과 평가에 적용 되었습니다.
맛 수용 체 G 단백질 결합 된 수용 체 (GPCRs) 이며 두 가지 주요 유형으로 분류 됩니다: 난 (T1Rs)을 입력 하 고 유형 II (T2Rs) 달콤한, umami, 그리고 쓴 화합물을 검출 하는. 맛 신호 폭포 tastant 바인딩 T1Rs 또는 T2Rs, 활성화는 heterotrimeric G 단백질의 α-gustducin와 Gβγ 이합체로 구성 된와 Gβγ subunits의 출시를 선도 시작 됩니다. Gβγ moiety 차례로 다운스트림 이펙터 효소 phospholipase C-β2 (PLC-β2) 자극. 활성화 된 PLC-β2 phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate 두 세포내 이차 메신저 [이노 시 톨-1,4,5-trisphosphate (IP3) 및 diacylglycerol], 그리고 IP3 바인딩 하로 hydrolyzes 그리고의 채널 수용 체 IP3 열 R3, 바인딩과 그물에서 칼슘 이온을 방출. 결국 일시적인 수용 체 잠재력 이온 채널 Trpm5의 열고 릴리스는 미각 신경4,,56,7에 신경 전달 물질 ATP의 리드. 그러나, 짠 맛과 신 맛의 신호 경로, umami, 다 정하고 쓴 맛8에서 다르고 독립적인 있습니다. 또한, 맛 GPCRs의 구성 요소 및 다운스트림 단백질 다양 한 여분 구강 조직에 존재합니다. 최근 연구는 α-gustducin 표시, 맛 신호의 주성분 장내 점 막에서 표현 될 발견 된다. 더 연구는 이러한 맛 신호 구성 요소 추가-구강 조직을9,10의 기능을 이해 필요 합니다.
여기에 설명 된 메서드 외 구강 조직에 표현 하는 미각 신호 단백질의 기능을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 우리는 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델 입맛에 신호 폭포를 묘사에 대 한 개발 된 유전자 변형 마우스 선 결합. 절차적 결함과 인간의 궤 양성 대 장 염을 병 적인 유사성 때문에 크게는 dextran 황산 나트륨 (DSS)-유도 IBD 모델은 다양 한 화학적으로 유도 된 대 장 염 모델11중 가장 널리 이용 되는. 이 연구에서 우리가 사용 α gustducin 불충분 한 쥐 대표 마우스 선으로 1) 조직의 형태학 적 변화를 분석 하 고 2)의 표현에 차이 시 금 창 자 점 막 면역과 염증에 α-gustducin의 소설 기능을 크린 시 토 킨 결에 염증에 관련 된 양적 및 질적으로 미각 신호 (단백질과 다른 단백질에에서 표현)의 기여 장 염증, 조직 손상 하 때 결정 유전자 변형된 마우스의 유전자에 대 한 라인이 메서드를 사용할 수 있습니다. 관심은 사용할 수 있습니다. 이 방법의 이점은 모두 화학 DSS의 행동 및 관심사의 유전자의 결핍에서 발생 하는 통합된 데이터를 얻기 위해 사용자가 활성화 됩니다. 이 방법은 그것의 감도 증가 하 고 세포 및 분자 수준에서 미묘한 장 변화를 공개를 더 개선할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 메서드는 quantitively에 채택 될 수 있다 염증 DSS 유도 IBD 마우스 모델에서 특정 미각 유전자의 돌연변이의 효과 결정. 활용, IBD의 최적의 유도 중요 한 단계입니다. Colitis의 개발은 마우스 스트레인, 주택 환경, 장내 microflora, 뿐만 아니라 관심의 유전자를 포함 한 여러 요인에 의해 영향을 받습니다. 다른 복용량을 테스트 하는 쥐의 작은 숫자와 DSS 관리의 기간 파일럿 실험을 수행 하는 것이 좋습?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81671016, 31471008, 및 31661143030) 및 건강의 국가 학회 (DC010012, DC015819)에서 교부 금에 의해 및 Siyuan 재단에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
References
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