Summary

Effetti del gusto segnalazione proteina Abolishment su infiammazione dell'intestino in un modello murino di malattia infiammatoria intestinale

Published: November 09, 2018
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Summary

Qui presentiamo un protocollo per studiare l’effetto di annullamento dei geni legati al gustazione sulle risposte immunitarie in un sodio del solfato del dextrano (DSS)-infiammatorie intestinali (IBD) la malattia del mouse modello indotto.

Abstract

Malattia infiammatoria intestinale (IBD) è uno dei disturbi gastrointestinali immuno-correlati, tra cui la colite ulcerosa e morbo di Crohn, che incide sulla qualità di vita di milioni di persone in tutto il mondo. IBD sintomi includono dolore addominale, diarrea e sanguinamento rettale, che possono derivare da interazioni tra microbiota dell’intestino, componenti alimentari, cellule epiteliali intestinali e le cellule immunitarie. È di particolare importanza per valutare come ogni gene chiave espressa in cellule epiteliali ed immune intestinale colpisce l’infiammazione del colon. Recettori del gusto accoppiati a proteine G, tra cui G proteina subunità α-gustducin e altre proteine di segnalazione, sono stati trovati nell’intestino. Qui, usiamo α-gustducin come rappresentante e descrivere un sodio del solfato del dextrano (DSS)-modello IBD per valutare l’effetto delle mutazioni del gene gustativo su immunità mucosa dell’intestino e infiammazione indotto. Questo metodo combina la tecnologia di knockout del gene con il modello IBD chimicamente indotto e quindi può essere applicato per valutare l’esito della nullificazione gene gustativo come pure altri geni che possono exuberate o smorzare la risposta immunitaria indotta da DSS nel colon. Topi mutanti vengono somministrati con DSS per un certo periodo durante il quale loro peso corporeo, sgabello e sanguinamento rettale sono monitorati e registrati. Presso diversi punti temporali durante l’amministrazione, alcuni topi sono euthanized, quindi le dimensioni e i pesi dei loro milze e i due punti sono misurati e tessuti dell’intestino sono raccolti e trattati per istologico e analisi dell’espressione genica. I dati mostrano che i risultati di knockout di α-gustducin in eccessiva perdita di peso, diarrea, sanguinamento intestinale, danno tissutale e topi infiammazione vs wild-type. Poiché la gravità dell’infiammazione indotta è influenzata da diversi ceppi di topi, habitat e dieta, ottimizzazione della durata di concentrazione e amministrazione di DSS in un esperimento pilota è particolarmente importante. Regolando questi fattori, questo metodo può essere applicato per valutare sia gli effetti anti – e pro-infiammatorie.

Introduction

Le due forme principali di malattia infiammatoria intestinale (IBD), morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) sono caratterizzate da condizioni infiammatorie croniche remittente o progressive dell’intestino con eziologia multifattoriale1,2 . Lo sviluppo delle IBD dipende dalla genetici, nonché determinati fattori ambientali quali dieta, uso di antibiotici e soprattutto, infezioni da patogeni. Tuttavia, l’eziologia e la regolamentazione dei meccanismi molecolari implicati IBD sono ancora poco chiari. Da qui, numerosi modelli animali chimicamente indotte di IBD sono stati costruiti e applicati per delineare la patogenesi e meccanismi di regolamentazione e valutare l’efficacia terapeutica umana3.

Recettori del gusto sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e sono classificati come due tipi principali: (T1Rs), tipo I e II (T2Rs) che consentono di rilevare composti amari, dolce e umami. Cascate di segnalazione del gusto vengono avviate da tastant T1Rs o T2Rs, attivando l’eterotrimerica G proteine leganti composto α-gustducin e un dimero Gβγ e che porta al rilascio delle subunità Gβγ. La frazione Gβγ a sua volta stimola l’effettore a valle dell’enzima fosfolipasi C-β2 (PLC-β2). Attivato PLC-β2 quindi idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisphosphate in due messaggeri intracellulari secondarie [inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo] e IP3 si lega a e aprire il suo canale-ricevitore IP3 R3, rilasciando ioni calcio dal reticolo endoplasmatico. Questo conduce infine all’apertura del canale di ioni potenziale transitorio del ricevitore Trpm5 e rilascio del neurotrasmettitore ATP sui nervi gustativo4,5,6,7. Ancora, le vie di segnalazione del gusto salato ed acido sono diversi e indipendenti da sapori amari8, dolce e umami. Inoltre, i componenti di gusto GPCR e proteine a valle esistono in vari tessuti extra-orali. Recenti studi hanno indicato quello α-gustducin, il componente principale del gusto di segnalazione, è trovato per essere espresso nella mucosa intestinale. Ulteriori studi sono necessari per comprendere le funzioni di questi gusto segnalazione componenti in tessuti extra-orali9,10.

Il metodo qui descritto è usato per caratterizzare le funzioni delle proteine di segnalazione gustative espresse in tessuti extra-orali. Uniamo una linea di topi transgenici sviluppata per la delineazione di Cascate di segnalazione in papille gustative con il modello di colite indotta chimicamente. In gran parte grazie alla sua semplicità procedurale e patologiche somiglianze alla colite ulcerosa umana, il Destrano solfato di sodio (DSS)-indotto IBD modello è stato più ampiamente utilizzato tra i vari modelli colite indotta chimicamente11. In questo studio, abbiamo usato i topi α-gustducin-carente come una linea di rappresentante del mouse per rivelare nuove funzioni di α-gustducin immunità mucosa dell’intestino e infiammazione 1) analizzando i cambiamenti morfologici nel tessuto e 2) analizzando le differenze nell’espressione di citochine legate alla infiammazione del colon. Questo metodo può essere utilizzato per determinare quantitativamente e qualitativamente i contributi di proteine di segnalazione gustativi (e altre proteine espresse nell’intestino), a danno di tessuto e l’infiammazione intestinale, quando topi geneticamente modificati per linee per i geni di interesse sono disponibili. Vantaggi di questo metodo sono consentendo agli utenti di ottenere integrata dei dati derivanti dalle azioni del DSS chimica e deficit del gene di interesse. Questo metodo può essere ulteriormente migliorato per aumentare la sua sensibilità e rivelare i cambiamenti sottili intestinali a livello cellulare e molecolare.

Protocol

Tutti gli esperimenti coinvolgenti topi sono stati esaminati e approvati dal istituzionale Animal Care e comitati di uso dell’Università di Zhejiang. Si consiglia di indossare adeguati dispositivi di protezione personali prima di eseguire questo protocollo. 1. preparazione di topi e DSS Tenere i topi knockout (α-gustducin- / -) ed età – sesso- e controllo di selvaggio-tipo di pari peso di corpo (α-gustducin+ +) topi C57BL/6 singolarmente in gabbie pulite.<br…

Representative Results

È stata stabilita una procedura IBD DSS indotta attraverso la somministrazione di 3% DSS in acqua potabile per α-gustducin-knockout (KO) e topi wild-type (WT). Rispetto ai topi WT, i topi knockout ha esibito più grave colite con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale (Figura 1). Dopo una somministrazione di DSS di 7 giorni, le differenze nell’integrità del tessuto sono state analizzate usando la macchiatura di H & E come il metodo …

Discussion

Questo metodo può essere impiegato per quantità determinare l’effetto delle mutazioni di specifici geni gustativi su infiammazione in un modello murino IBD indotta da DSS. Per sfruttare al meglio, induzione ottimale di IBD è un passo fondamentale. Lo sviluppo di colite è influenzato da diversi fattori, tra cui topo, housing ambiente, microflora intestinale, così come i geni di interesse. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con un piccolo numero di topi per testare diversi dosaggi e durate di amministrazio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni da parte del National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 e 31661143030) e il National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e dalla Fondazione Siyuan.

Materials

Antibody
CD45 BD Biosciences 550539
CD3 BD Biosciences 555273
B220 BD Biosciences 550286
CD11b BD Biosciences 550282
Ly6G BD Biosciences 551459
Reagent
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) MP Biomedicals 2160110
Streptavidin-HRP complex BD Pharmingen 551011
H&E Staining Kit BBI Life Sciences E607318
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sangon Biotech B548117
FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) Roche 4913850001
MMLV Reverse Transcriptase, GPR Clontech,TaKaRa 639574
TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit  TaKaRa 9767
BD 10 ml Syringe BD Biosciences 309604
Instruments and equipment
balance
scissors 
forceps
centrifuge
qPCR machine
staining jars
Software
Imag-Pro Plus  Media Cybernetics, Inc. 

References

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Cite This Article
Du, Y., Liu, Q., Luo, X., Zhao, D., Xue, J., Feng, P., Margolskee, R. F., Wang, H., Huang, L. Effects of Taste Signaling Protein Abolishment on Gut Inflammation in an Inflammatory Bowel Disease Mouse Model. J. Vis. Exp. (141), e58668, doi:10.3791/58668 (2018).

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