How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Daniel Bruce; Emily Cardew; Stefanie Freitag-Pohl; Ehmke Pohl

doi:10.3791/58666

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Biochemistry

Como estabilizar a proteína: telas de estabilidade Thermal turnos, ensaios e Nano diferencial digitalização fluorimétrico no projeto vírus-X

Published: February 11, 2019

doi:

10.3791/58666

Daniel Bruce¹, Emily Cardew¹, Stefanie Freitag-Pohl², Ehmke Pohl^1,2

¹Department of Biosciences,Durham University, ²Department of Chemistry,Durham University

Summary

Um protocolo é apresentado para rapidamente testar a estabilidade térmica das proteínas em uma variedade de condições através de ensaios de mudança térmica e nano diferencial de varredura fluorimétrico. Sistemas tampão, sais e aditivos, juntos composto por três telas de estabilidade única, são doseados com proteínas para identificar buffers adequados para estudos funcionais e estruturais.

Abstract

O projeto de Horizon2020 vírus-X foi estabelecido em 2015 para explorar o virosphere de biótopos extremos selecionados e descobrir novas proteínas virais. Para avaliar o valor potencial de biotécnica destas proteínas, a análise da proteína estruturas e funções é um desafio central neste programa. A estabilidade da amostra de proteína é essencial para fornecer resultados de ensaio significativo e aumentar a crystallizability dos alvos. O ensaio de mudança térmica (TSA), uma técnica baseada em fluorescência, é estabelecido como um método popular para otimizar as condições de estabilidade da proteína em alta produtividade. Na CST, os trabalhador assalariados fluorophores são corantes extrínsecas, ambientalmente sensíveis. Uma alternativa, técnica semelhante é nano diferencial de varredura fluorimétrico (nanoDSF), que se baseia em fluorescência nativa da proteína. Apresentamos aqui uma osmólito romance, tela um 96-condição de aditivos orgânicos projetado para orientar ensaios de cristalização através de experimentos preliminares da TSA. Juntamente com pH anteriormente desenvolvidos e telas de sal, o conjunto de três telas fornece uma abrangente análise da estabilidade da proteína em uma ampla gama de sistemas tampão e aditivos. O utilitário das telas é demonstrado na análise TSA e nanoDSF de lisozima e proteína X, uma proteína do alvo do projeto vírus-X.

Introduction

Muitas enzimas de biotecnologia-útil originam fontes virais, tais como o tabaco etch de protease do vírus (TEV)¹ e rinovírus humano tipo de protease 3C (VFC 3C)². O projeto (Figura 1) Horizon2020 vírus-X³. O objetivo deste programa é (um) para estender a escala das propriedades de famílias de enzima conhecida e (b) para caracterizar o romance enzimas de função ainda desconhecida (enzima X). Determinação da estrutura cristalográfica desempenha um papel essencial na caracterização da proteína alvo, em particular nos casos onde as sequências de proteínas têm evoluído para além do reconhecimento⁴. Estabilidade da proteína é um fator chave no processo de cristalização; as amostras devem ser estruturalmente sólido e conformationally homogênea ao longo de um período de tempo, a forma de alta qualidade, diffracting cristais. Além disso, é essencial para os ensaios de atividade as proteínas existentes em sua conformação ativa, que também pode ser facilitada por um ambiente favorável e molecular.

Apesar do desenvolvimento na tecnologia disponível para crystallographers, cristalização de proteínas permanece um demorado e trabalhoso processo empírico⁵. Experimentos preliminares de biofísicos para melhorar a estabilidade da proteína em solução dão claramente um melhor ponto de partida para a cristalização de proteínas e consomem normalmente apenas uma quantidade relativamente pequena de proteína amostra⁶^,⁷^, ⁸^,⁹. O grande número de proteínas do alvo a ser estudado neste projeto também necessita de ensaios de estabilidade escalável, de alto rendimento. Um dos métodos mais populares para pré-cristalização caracterização biofísica das proteínas é o ensaio de mudança térmica (também conhecido como TSA ou diferencial de varredura fluorimetria, DSF)¹⁰^,¹¹.

ATA emprega uma tintura fluorescente ambientalmente sensíveis para rastrear a desnaturação térmica das amostras da proteína. Muitos corantes utilizados têm atividade de fluorescência variável dependendo da polaridade de seu entorno, muitas vezes exibindo uma saída alta fluorescência em ambientes hidrofóbicos mas passando por têmpera rápida em ambientes polares¹². Proteínas causam geralmente pronunciado aumento na fluorescência do corante como seus núcleos hidrofóbicos se tornam expostos durante a desnaturação, muitas vezes seguida por uma diminuição na fluorescência do corante temperaturas muito elevadas, como as proteínas começam a agregação (Figura 2).

Enquanto um corante sensível-hidrofobicidade é muitas vezes uma boa escolha para um corante TSA de uso geral, pode ser inadequado para proteínas com regiões hidrofóbicas grandes, expostas ao solvente, que muitas vezes apresentam fluorescência fundo prejudicialmente elevado. Fluorophores com modos alternativos de ação existem (ver discussão), mas em vez disso pode ser desejável para rastrear a desnaturação através da fluorescência intrínseca da proteína com nanoDSF.

Resíduos de triptofano que estão enterrados em regiões apolares de uma proteína fluorescem com um máximo de emissão de 330 nm. Como se desenrola uma amostra de proteína e estes resíduos tornam-se exposta a um solvente polar, sua emissão máxima sofre uma mudança de bathochromic para 350 nm¹³. nanoDSF explora esta mudança de emissão máxima para sondar o desdobramento de uma amostra de proteína sem a necessidade de fluorophores extrínseco¹⁴.

Derreta as curvas mostrando etapas de desnaturação único podem ser analisadas por encaixe dados a um modelo sigmoidal de Boltzmann. A temperatura no ponto de inflexão da transição desdobramento (T_m) é usada como uma medida quantitativa da estabilidade térmica de proteína e um ponto de referência para comparar a favorabilidade de condições diferentes.

Curvas de derretimento da mesma proteína em diferentes condições às vezes possuem um grau de heterogeneidade que pode fazer uma montagem de Boltzmann sigmoidal inviável. Para discernir os valores de_m T de dados que se desvia da topologia do clássico curva, métodos numéricos podem ser usados como aqueles empregados em NAMI, um de programa de análise do código-fonte aberto TSA dados¹¹. Quadros termodinâmicos alternativos também podem ser usados para analisar as curvas mais complexas, com várias etapas de desnaturação, tais como a metodologia de ProteoPlex¹⁵.

As telas de estabilidade foram projetadas para uso em experimentos TSA e nanoDSF para rapidamente identificar condições favoráveis para uma proteína do alvo (Figura 3, composições de tela estão disponíveis nas informações complementares). Informações obtidas com as telas podem ser usadas em muitas fases do pipeline cristalográfica, incluindo: amostra de armazenamento; purificação, minimizando a perda de rendimento através da proteína a desdobrar-se durante o processo de purificação; ensaio de projeto, reforçando a funcionalidade da proteína em ensaios de atividade com estabilizando termicamente amortecedores e, finalmente, cristalização, guiando a ensaios de cristalização projetado racionalmente.

Escolher uma base de sistema tampão apropriado para uma amostra de proteína é vital; valores de pH incompatível podem levar à desativação ou desnaturação de uma proteína. No entanto, a presença de moléculas de co cristalizado tampão resolvido em um grande número de estruturas de cristal de raio-x (tabela 1) também pode ser indicativa de um efeito estabilizador que é separado do Regulamento simples pH e em vez disso decorre do produto químico características da molécula de reserva.

Formulado a utilizar vários dos amortecedores¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ ao lado de outros sistemas comumente biologicamente compatível com tampão do bom, a tela de pH é projetada para deconvolute o efeito químico de uma molécula de reserva na estabilidade da proteína do real pH da solução resultante. Fornecendo três valores de pH para cada sistema tampão e incorporando redundância de valor de pH entre os diferentes sistemas, a tela de pH pode identificar os valores de pH favoráveis e sistemas-tampão favorável para uma proteína do alvo.

A tela de sal comumente contém sais de laboratório, bem como chaotropes, chelants, metais pesados e agentes redutores. A tela pode dar uma indicação geral da afinidade de uma amostra de proteína para os ambientes com alta força iônica, mas cada subgrupo dos compostos também pode fornecer informações sobre a potencial estrutura de uma proteína. Por exemplo, um quelante significativamente desestabilizar uma proteína pode ser indicativo de metais estruturais importantes dentro da amostra. Se a amostra é também fortemente estabilizada por um cátion de metal dentro da tela, isto pode fornecer um ponto de partida promissor para novas experiências estruturais.

Osmólitos são compostos solúveis que afetam as propriedades osmóticos do seu meio ambiente. Na natureza, pode ser usados como “acompanhantes químicas”, reforçando o dobramento de proteínas desordenadas e estabilizando-os, especialmente em condições de estresse a²⁰^,²¹^,²². Estas características torná-los atraentes aditivos em cristalografia de proteínas; utilizável como crioprotectores durante a colheita de cristal, montagem e armazenamento de processos²³. Potencial de uso dos osmólitos também se estende para a purificação de proteínas. Uma proporção significativa de proteínas recombinantes expressado em e. coli pode ser difícil recuperar no estado nativo usando métodos de purificação padrão e insolúvel. Osmólitos podem ser usados para estabilizar e salvar as proteínas de frações insolúveis, purificação crescente produz²⁴.

A tela de osmólito foi projetada usando estabelecidos compostos presentes no banco de dados de proteínas entradas²⁵ e²⁶ Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vias (DEOP) banco de dados e iterativamente otimizado usando proteínas padrão. A tela é construída em torno de oito subclasses de osmólito: glicerol, açúcares e polióis, detergente não-sulfobetaines (NDSBs), betaínas e seus análogos, organofosforados, dipeptídeos, aminoácidos e seus derivados e um grupo de diversos final. Cada osmólito está presente em várias concentrações, baseadas na sua solubilidade e gamas de concentração eficaz para comparação.

Protocol

1. preparação da amostra de proteína Formular as telas de estabilidade como 500 alíquotas µ l em blocos de 96 poços e selar para armazenamento. Transferência de 10 µ l de cada condição de uma tela de estabilidade para a correspondente bem de uma placa de 96 poços, usando uma pipeta multicanal para poupar tempo(Figura 4). Prepare-se 1 mL de uma solução de proteína-1 de mL aproximadamente 1 mg em um sistema de amortecedor apropriado. Enquanto a composição de um amortecedor apropriado varia com cada amostra de proteína, um bom amortecedor primeiro tentar é fosfato de sódio 10 mM com 100 mM de NaCl, pH 7,2.Nota: As concentrações de proteína aceitáveis variam de caso a caso, mas gamas de concentração de 0,5 – 5 mg mL-1 normalmente produzem curvas analisáveis. Buffers de diluído são recomendados para uso com as telas de estabilidade para evitar os efeitos de cada condição de mascaramento. Composições de reserva típicos são cerca de 10 mM de tampão com cerca de 100 mM de NaCl. Se realizar um experimento TSA, adicione corante laranja de SYPRO para a amostra de proteína para uma concentração final de 20 x. Misture por inversão ou breve num Vortex. Transferi 10 µ l da solução da proteína para cada poço da placa de 96 poços, preparado no passo 1.1 (Figura 4B). Selar e centrifugar a placa de 96 poços para 2 min a 600 x g para garantir que o componente de amostra e tela de proteína são misturados (Figura 4C). Selar novamente a tela de estabilidade bloco poço profundo e armazenar a tela em 4 ° C por até 4 meses. Armazene a sal tela na escuridão, como alguns componentes são fotossensíveis. Se realizar um experimento de nanoDSF, vá para a etapa 2. Se realizar um experimento TSA, pule para a etapa 4. 2. preparar uma nanoDSF experiência Verifique se o equipamento está limpo, com especial atenção para qualquer poeira perto do rack de amostra. Se o sistema tiver um espelho Retrodispersão, limpá-lo usando um tecido de fiapos e etanol. Abra a gaveta de amostra pressionando o botão Gaveta aberta . (Figura 5A). Carregar os capilares com aproximadamente 10 µ l de cada poço da placa de 96 poços por tocar uma das extremidades do capilar para a solução e, em seguida, colocá-los nos correspondentes titulares capilares da cremalheira da amostra (Figura 5B). Tenha cuidado para não contaminar o meio dos capilares com impressões digitais, etc., como isto poderia interferir com as leituras de fluorescência durante todo o experimento. Imobilize os capilares com a banda magnética de selagem (Figura 5-C). 3. um nanoDSF experiência de programação. Inicie uma varredura preliminar para detectar a posição e a intensidade de cada capilar pressionando o botão Iniciar verificação descoberta na guia Descoberta Scan aumentar ou diminuir a força de excitação incidente de uma potência inicial de 10% até o pico de cada varredura capilar é entre 4.000-12.000 unidades (Figura 5-D). Para garantir que a amostra é dobrada e suficientemente concentrada, recomenda-se uma varredura inicial derreter com um acentuado gradiente de temperatura. No guia De derretimento Scan , programa um derretimento digitalizar, definindo a opção de Inclinação de temperatura para 7,0 ° C min-1, Começar a temperatura a 25 ° C e a Temperatura final de 95 ° C, em seguida, lançar o nanoDSF experiência pressionando o Começar a fusão botão. Se o resultante do derretimento curvas não mostrar um ponto de inflexão detectável, considere a concentrar a amostra mais ou verificando se a proteína é dobrada corretamente. Repita as etapas de 2,1-2,4 para preparar as amostras para uma experiência completa. No guia De derretimento Scan , programa um derretimento digitalizar definindo a opção de Inclinação de temperatura de 1,0 ° C min-1, Temperatura final de 95 ° C e Começar a temperatura a 25 ° C, em seguida, iniciar o nanoDSF experiência pressionando o botão Começar a derreter . 4. realizar um experimento TSA Abra a gaveta de amostra pressionando firmemente o travessão no lado direito da gaveta. Coloque a bandeja de 96 poços no sistema de RT-PCR com poço A1 para a traseira esquerda (Figura 4-D). Clique no botão Novo experimento para começar a configurar um experimento TSA. Na guia Propriedades de experimentar , clique na opção de Curva de derreter quando pediu que tipo de experiência você quer configurar? e a outra opção quando perguntado quais os reagentes que quer usar para detectar a sequência alvo? No placa Setup / definir metas e amostras tab, digite um nome de destino, em seguida, definir o repórter como ROX e Quencher como nenhum. No placa Setup / atribuir metas e amostras guia, atribuir a cada poço da placa de 96 poços para o nome de destino inserido na etapa anterior. Na mesma aba, defina selecionar o corante para usar como referência o passivo como nenhum. Na aba Executar método , exclua etapas até que haja um total de três. Definir o primeiro passo para 25,0 ° C, rampa de 100%, tempo 00:05; a segunda etapa a 95,0 ° C, rampa taxa de 1%, tempo 01:00; o terceiro passo para 95,0 ° C, rampa de 100%, tempo 00:05. Optar por coletar dados usando o menu suspenso de Coletar dados ou pressionando o ícone de Coleta de dados (Figura 6). Defina o Volume de reação por bem a 20 µ l. Pressione o botão Iniciar Executar para iniciar o experimento TSA. 5. análise de dados Escolha um comprimento de onda para traçar uma curva de derretimento com. Para nanoDSF experiências, a relação entre as intensidades de fluorescência em 330 nm e 350 nm (correspondente a triptofano em ambientes polares e apolares, respectivamente)13 é comumente usado. Para a maioria dos CST, a máximo de emissão de tintura é adequada para plotagem de curva de derretimento (o máximo de emissão de SYPRO laranja é 569 nm)12. Calcule os valores dem T de cada condição, determinando o ponto de inflexão (s) de cada curva de derreter. A maioria dos sistemas de nanoDSF calcular automaticamente valores de Tm através da diferenciação numérica das curvas de degelo após a aquisição de dados. Se o software utilizado não calcula automaticamente valores de Tm , software livre, alternativa baseada em GUI como NAMI11 pode automatizar a análise dos dados e a jusante de processamento, dando a opção de produzir um heatmap sumariar Tm valores para toda a experiência de 96 poços (a referência de acompanhamento fornece orientações e recursos para processamento de dados com NAMI). Compare os valores dem T de todas as condições pesquisadas. As telas de estabilidade contêm dois poços em cada tela (A1 e A2) que contêm apenas água. Tomar os valores somente água como referência permite o cálculo dos valores dem ΔT, abordando os erros sistemáticos e permitindo fácil comparação dos efeitos de estabilização. Valores mais altos dem T indicam condições termicamente estabilizadores que são recomendadas para utilização a jusante. Promissoras condições frequentemente apresentam uma dependência de concentração na sua estabilização.

Representative Results

Lisozima foi analisada com as telas de estabilidade e proteína X, uma proteína do alvo no projeto vírus-X, foi analisada com a tela do osmólito. Ambas as proteínas geralmente produzidas derretem curvas com transições de desnaturação claramente definidos em experimentos tanto TSA e nanoDSF (ver figuras para curvas representativas de acompanhamento). Em alguns casos onde as amostras que fiz não produzir curvas interpretável com uma transição de desnaturação definidos foram interpretadas como desnaturadas e não incluídas em comparações dem T. A Figura 7 mostra os resultados da amostra tela do sal, exemplificando as propriedades estabilizar termicamente de cloreto de amónio em direção a lisozima. Dependências de concentração como o mostrado acima muitas vezes são indicativas de condições promissoras, mas pode ser útil comparar os resultados de aumento da concentração do íon com vários sais diferentes para ver se a estabilização térmica geralmente surge de um aumento da força iônica do tampão ou se a presença de íons específicos confere estabilidade adicional. Comparação dos valores dem T de lisozima com a tela de pH (Figura 8) revela dois pedaços de informação. Em primeiro lugar, há uma tendência geral de aumento da estabilidade com valores de pH a diminuir. Em segundo lugar, os valores de intervalo de Tm obtidos usando sistemas de reserva diferentes com valores de pH idêntico podem ser significativos. Dados na Figura 8 sugerem que o acordo entre TSA e nanoDSF neste experimento é geralmente boa, mas nanoDSF mostra uma tendência para identificar os valores dem T ligeiramente superiores e ligeiramente maior Tm desloca-se do TSA. No entanto, alguns poços com valores de pH acima de 8,5 mostram grandes discrepâncias entre os valores dem T obtidos de TSA e nanoDSF. Diferenças potencialmente poderiam ser atribuídas ao mecanismo de desnaturação da proteína em valores de pH diferentes; por exemplo, um corante de hidrofobicidade sensível poderia dar um comparativamente baixos Tm leitura se regiões hidrofóbicas de uma proteína se tornam expostas ao solvente significativamente mais rápido do que o ambiente de mudanças de resíduos de triptofano em polaridade. A Figura 9 mostra um heatmap de Tm valores obtidos com lisozima usando a tela do osmólito. Condições com os maiores aumentos dem T em comparação com os poços de controle (poços A1 e A2, contendo água desionizada) são de cor azul escuro. Condições de estabilização especialmente identificadas na Figura 9 incluem glicerol, 1 M D-sorbitol, hypotaurine de 100 mM e 10 mM Ala-Gly (poços A4-A6, A9, E7 e F8, respectivamente). A Figura 10 mostra um heatmap de Tm valores obtidos com proteína X. TSA e nanoDSF com a tela de osmólito revelaram que a maioria dos osmólitos testados dar também um pequeno aumento no Tm (dentro de 1 ° C) ou ter um efeito negativo a estabilidade da proteína x. Em particular, ácido dipicolínico numa concentração de 10 mM (bem D1) aparece desnaturar a amostra em temperatura ambiente. Os resultados da TSA e nanoDSF identificam rapidamente o ácido dipicolínico como aditivo incompatível para proteína X, que devem ser evitados quando se trabalha com a proteína. No entanto, altas concentrações de D-sorbitol e arabinose (poços A9 e B9, ambos a 1 M) bem como glicerol e TMAO (poços A4-A6 e E1, respectivamente) foram identificados como estabilizar termicamente. Lisozima, combinações de condições produzindo os maiores valores dem T de cada tela de estabilidade foram testadas para sonda para um efeito sinérgico combinado. A Figura 11 mostra um aumento geral nos valores de Tm como mais componentes do sistema tampão (pH, sal e osmólito) são adicionados. No caso de MES, sulfato de amónio e D-sorbitol, um Tm aumentar tão grande quanto 10 ° C pode ser observado quando todos os componentes estão presentes em relação ao MES sozinho. A Figura 11 mostra que um perceptível efeito sinérgico pode ocorrer quando os componentes individuais de um buffer são otimizados e combinados com as telas de estabilidade. Em termos mais gerais, a Figura 11 ilustra também a magnitude dos valores dem ΔT que pode ser observada em TSA e nanoDSF experiências. A magnitude da ΔTm realizável varia significativamente com base no sistema de proteína, mas qualquer valor dem ΔT ao redor e acima de 5 ° C, muitas vezes é indicativo de um efeito benéfico do estabilizador. Figura 1 : Bioprospecção. Coleta de amostra de um ambiente de extrema no projeto vírus-X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: esquemático do TSA. Anotado o exemplo de uma curva de derretimento típico obtido a partir de um experimento TSA. Esta curva é característica do desdobramento da proteína de “dois Estados” clássica, onde a população de amostra faz a transição de dobrado para desnaturado sem intermediários parcialmente dobrado detectáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3 : Estabilidade telas de fluxo de trabalho. Fluxo de trabalho padrão de otimização de buffer usando as telas de estabilidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4 : Fluxo de trabalho de padrão TSA experimentar com as telas de estabilidade. Da esquerda para a direita: (A) alíquotas Pipetting as telas de estabilidade em uma placa de 96 poços. (B) amostra de proteína com uma tintura fluorescente na placa de pipetagem. (C) a placa antes de centrifugação de vedação. (D) colocando a placa em um sistema de RT-PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: fluxo de trabalho de um experimento de padrão nanoDSF. (A) abrindo o capilar cremalheira de carregamento. (B) a carregar os capilares dentro do rack. (C) os capilares com a tira de vedação magnética de imobilização. (D) uma experiência de programação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6 : Interface de usuário para o sistema de RT-PCR. Um experimento TSA foi programado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7 : Dados de exemplo de tela de sal. (A) relação entre as intensidades de fluorescência em 350 nm vs 330 nm para um experimento de nanoDSF livre de rótulo com lisozima. As amostras correspondem aos poços C7-C12 da tela sal (1,5 M – cloreto de amônio 0,2 M). Os valores dem T calculados para cada condição são sobrepostos sobre a trama. (B) Resumo dos valores dem T calculado a partir dos dados apresentados na Figura 7A. As intensidades de fluorescência (C) no 590 nm para uma experiência TSA com lisozima com um corante repórter hidrofobicidade sensíveis. Como Figura 7A, as amostras correspondem aos poços C7-C12 da tela do sal. Valores calculados dem T são sobrepostos no gráfico. (D) Resumo dos valores dem T calculado a partir de dados presentes na Figura 7C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: dados de exemplo de tela de pH. Resumo de Tm turnos obtidos com lisozima e a tela de pH. Cada ponto representa uma condição de independente; aponta para o mesmo valor de pH é de sistemas de reserva diferentes com o mesmo pH. Tm turnos são calculados em relação a um controle Tm de 68,0 ° C para experimentos TSA e 71,9 ° C para experimentos de nanoDSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9 : Dados de exemplo de tela de osmólito (lisozima). Resumo de Tm valores obtidos de um experimento de nanoDSF livre de rótulo com lisozima e cada poço da tela osmólito. Valores dem T (em ° C) são comparados aos poços A1 e A2 que contêm água, como um controle. Um heatmap foi gerado com base nos valores dem ΔT comparados (azul denota um aumento dem T e vermelho uma diminuição dem T). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 10: dados de exemplo de tela de osmólito (proteína X). (A) Resumo de Tm valores obtidos de um experimento de nanoDSF livre de rótulo com proteína X e a tela do osmólito. Tm valores são comparados aos poços A1 e A2, que contêm a água como um controle. Um heatmap foi gerado com base nos valores dem ΔT comparados (azul denota um aumento dem T e vermelho uma diminuição dem T). (B) nanoDSF curvas obtidas bem A9 (1 M D-sorbitol, uma condição de estabilização) e D1 (ácido dipicolínico de 10 mM, uma condição desestabilizadora). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 11 : Buffer efeito otimização na T.m. Valores de TSA Tm de lisozima, combinada com as condições de cada tela que concedido o maior aumento em Tm. 100 mM de ácido acético, pH 4.2 e 100mm MES, pH 5.6, foram escolhidos como os sistemas de reserva, ao lado de sulfato de amônio 1,5 M como o sal. Osmólito concentrações eram idênticas aos encontrados na tela osmólito: 10mm Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50mm, L-lisina e hypotaurine de 100 mM. Barras de erro representam o desvio padrão de seis repetições. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Molécula Código do PDB Frequência de cristalização co Fosfato PO4 5132 Acetato de ATO 4521 -(N-Morpholino) 2-etanesulfónico ácido (MES) MES 1334 Tris (hidroximetil) aminometano (tris) TRS 1155 Formiato FMT 1072 Tabela 1: Resumo da frequência de cristalização co molécula tampão nas entradas de banco de dados da proteína (PDB). Dados obtidos através de PDBsum16 de um total de 144.868 entradas (corretos a partir de 05/12/18). Informações complementares. Por favor clique aqui para baixar este arquivo. Suplementares tabela 1. Por favor clique aqui para baixar este arquivo. Suplementares tabela 2. Por favor clique aqui para baixar este arquivo. Suplementares tabela 3. Por favor clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Aspectos críticos dentro do protocolo incluem a etapa de centrifugação e vedação adequada da placa de 96 poços para experimentos TSA (passo 1.5). Centrifugação garante que a condição de amostra e tela de proteína entram em contato e misture. Além disso, se uma placa sem lacre é usada para um experimento TSA, existe um risco significativo de solvente evaporando durante todo o experimento, causando um aumento na concentração de amostra e aumentando a possibilidade de agregação de proteínas prematura.

CST e nanoDSF são favoráveis a uma ampla gama de amostras da proteína; a grande maioria das amostras pode produzir curvas interpretable derreter com um corante repórter baseada na hidrofobicidade ou através de nanoDSF sem corantes. Se as fontes padrão de fluorescência não são adequadas para sua proteína, a modificação mais simples para o protocolo que pode ser explorado é a escolha de fluoróforo. Vários corantes alternativos poderiam ser apropriados para experimentos TSA. Os exemplos incluem N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), um composto fluorescente após reagir com um tiol,²⁷e 4 – julolidine (dicyanovinyl) (DCVJ), um composto que varia sua fluorescência baseada o rigidez de seu ambiente, aumentando sua fluorescência como uma amostra de proteína se desdobra²⁸^,²⁹ (o corante este último muitas vezes requer altas concentrações de amostra).

Métodos alternativos de análise de curva de fusão estão disponíveis se T_m não é calculado automaticamente pelo software do instrumento. Se dados são homogêneos e apenas a um passo de desnaturação é aparente nas curvas derreter, um conjunto de dados truncado pode ser equipado com um sigmoide com a seguinte equação de Boltzmann:

Onde F é a intensidade de fluorescência à temperatura T, F_min e_máx F é as intensidades de fluorescência antes e após a transição de desnaturação, respectivamente, T_m é a temperatura do ponto médio da transição de desnaturação e C é a inclinação no T_m. Enquanto este método funciona bem para processos de desnaturação de duas etapas simples, é inadequado para curvas de derretimento complexos com múltiplas transições.

Uma das grandes vantagens da TSA é a sua acessibilidade; Experimentos TSA podem ser executados em qualquer sistema de RT-PCR com filtros em comprimentos de onda adequados para a tintura de fluorescência empregadas. Isso juntamente com o baixo custo dos consumíveis, facilidade de operação e relativamente baixa quantidade de proteínas necessárias, fazer TSA uma técnica valiosa para uma ampla gama de escalas do projeto, tanto na indústria e academia.

Bem como indicando condições favoráveis de reserva, as telas contêm alguns poços que podem dar pistas para a presença de metais estruturais dentro de uma proteína de amostra. Poços que podem ser de particular interesse na tela do sal são G6 e G7, que contenham EDTA 5 mM e 5 mM EGTA, respectivamente. Desestabilização térmica significativa nesses poços pode ser indicativa de importantes íons metálicos na proteína que são sequestrados pelo chelants. Compostos dentro da tela de osmólito também potencialmente podem fornecer pistas para a função de uma proteína. Muitos dos compostos na tela pertencem a classes da molécula que são substratos comuns de enzimas. Por exemplo, a estabilização geral oferecida pela sacáridos (presentes em poços A11-B10) para lisozima poderia ser atribuída à sua semelhança estrutural com estabelecida substratos da enzima, oligômeros de N-acetilglicosamina³⁰.

Os TSA e nanoDSF protocolos descritos acima também podem ser adaptados para estudar interações proteína-ligante. Ligantes que se ligam especificamente a uma proteína podem aumentar a sua estabilidade térmica, introduzindo novas interações dentro do complexo. Uma mudança positiva de dose-dependente na proteína T_m é um sinal promissor de uma interação bem sucedida proteína-ligante. A velocidade, produtividade e baixo custo de triagem de bibliotecas compostas com CST tornou um método muito popular na descoberta da droga do cedo-estágio.

Otimizar as condições de reserva de proteínas alvo e seus complexos de ligante pode ser essencial para o sucesso do projeto, como muitos exemplos de literatura demonstram³¹^,³²^,³³^,³⁴. Com um ensaio típico levando abaixo dos 2 h, incluindo o tempo de instalação, CST e nanoDSF juntamente com telas de estabilidade representam uma técnica rápida e barata para otimizações de reserva.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o programa União Europeia do Horizonte 2020 pesquisa e inovação (concessão acordo n ° 685778). Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de pesquisa de ciências biológicas e biotecnologia (BBSRC, concessão números BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB agradece o BBSRC doutorado treinamento parceria Newcastle-Liverpool-Durham para uma bolsa de estudo e Durham University departamento de Biociências por contribuir para o financiamento deste trabalho. Agradecemos a Ian Edwards para sua ajuda e o departamento de Durham University departamento de química espectrometria de massa para sua análise instrumental de proteína X. Nós estamos gratos ao Arnthor Ævarsson por seu trabalho com o projeto de vírus-X e graças também à Claire Hatty e NanoTemper GmbH para empréstimos e ajudando com o sistema de Prometheus NT.48 para este projeto. Finalmente, obrigado a Frances Gawthrop Tozer sementes para seu apoio como parte do prêmio BBSRC iCASE.

Materials

Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (T_m and T_onset), critical denaturant concentrations (C_m), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (T_agg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml^-1).

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Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project. J. Vis. Exp. (144), e58666, doi:10.3791/58666 (2019).

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