タンパク質を安定化する方法: 熱安定性画面シフト試金およびナノ示差走査 X ウイルス プロジェクト/蛍光定量

安定画面で検定したリゾチームとウイルス X プロジェクトのターゲット蛋白質蛋白質 X osmolyte 画面で検定しました。一般的に生産両方の蛋白質を溶かす TSA と nanoDSF の両方の実験 (代表的な曲線の数値を伴うを参照) で変性の明確に定義された遷移曲線。いくつかの場合どこ定義された変性転移は、解釈曲線を生成したサンプルの変性とに含まれていない Tm比較として解釈されました。 チームパワーに向かってリゾチーム塩化アンモニウムの熱安定化特性塩画面からサンプルの結果を図 7に示します。上記などの濃度依存性は、有望な条件を示すが、それは熱安定化が一般的にから発生したかどうか参照してくださいにいくつかの異なる塩のイオン濃度の増加の結果を比較することができます、バッファーのイオン強度の増加や、特定のイオンの存在が追加の安定性を付与するかどうか。 PH 画面 (図 8) リゾチーム Tm値の比較では、2 つの情報を明らかにします。まず、pH 値の減少と安定性の増加の一般的な傾向があります。第二に、同じ pH 値の異なるバッファー システムを使用して得られる範囲の Tm値は、大きくなります。 図 8のデータでは、TSA は、この実験では nanoDSF 間の合意は、一般的に良いが、nanoDSF はわずかにより高い T のm値と同一視する傾向を示しています、TSA よりわずかに大きい Tmシフトを示唆しています。しかし、pH 値が 8.5 以上のいくつかの井戸は、TSA は、nanoDSF から取得された Tm値に大きな差を示します。違いが異なる pH 値でタンパク質の変性のメカニズムに起因する可能性があります。たとえば、疎水性感受性色素は比較的低い Tmかどうか蛋白質の疎水性領域にさらされる溶媒トリプトファン残基の変更の環境よりも大幅に高速極性で読書を与えることができます。 Osmolyte スクリーンを用いたリゾチームで得られた Tm値のヒートマップを図 9に示します。コントロール井戸 (ウェルズ A1 と A2、脱イオン水を含む) と比較して最高の Tm増加の条件は、濃い青が着色されます。図 9で識別された特に安定条件は、グリセロール、1 M D-ソルビトール、100 mM ヒポタウリン、10 mM 翼 Gly (井戸 A4 A6、A9、E7、F8、それぞれ) に含まれます。 図 10に示すタンパク質 X. TSA で得られた Tm値のヒートマップと浸透テストの大半 Tm (内 1 ° C) のいずれかマイナーな増加を与えるか、悪影響を及ぼす Osmolyte 画面 nanoDSF 実験が明らかにタンパク質 X の安定性。特に、室温でサンプルを変性するジピコリン酸濃度 10 mM (よく D1) が表示されます。TSA と nanoDSF の結果は、すぐに蛋白質を操作するときに避けるべきである蛋白質 X の互換性のない添加物としてジピコリン酸を識別します。それにもかかわらず、高濃度の D-ソルビトールとアラビノース (ウェルズ A9 および B9 1 M の両方)、グリセリン、TMAO (井戸 A4 A6 や E1、それぞれ) 熱安定化として識別されました。 リゾチーム、各安定画面から最高の Tm値を降伏の条件の組み合わせが相乗相乗効果のプローブ テストされました。図 11 Tm値の一般的な増加で表示バッファー システムのより多くのコンポーネント (pH、塩、osmolyte) が追加されます。MES のアンモニウムの硫酸塩、D-ソルビトール、場合 Tmは 10 ° C 観察できるすべてのコンポーネントが存在する場合だけで MES と比較して大きく増加します。図 11は、バッファーの個々 のコンポーネントを最適化され、安定画面と組み合わせるときに、顕著な相乗効果が発生することが示しています。 一般的なノートでは、図 11は、TSA の nanoDSF 実験を観察することができます ΔTm値の大きさを示しています。ΔTm達成の大きさ異なります蛋白質システムに基づいて大幅が、5 ° c 前後 ΔTm値はしばしば安定効果を示す。 図 1: バイオプロスペクティング。ウイルス X プロジェクトで極端な環境からサンプルのコレクションです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2: TSA 概略図。TSA の実験から得られた典型的な融解曲線の例。この曲線は、古典的な”2 つの状態「タンパク質の変性の特徴, サンプル人口の遷移検出可能な部分的に折り返されている中間体なしに変性折り返されていますいます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: 安定画面ワークフロー 。安定画面を使用してバッファー最適化の標準的なワークフローです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: TSA 実験安定画面で標準のワークフロー 。左から右へ: 96 ウェル プレートに安定画面の (、) Pipetting 因数。(B) プレート蛍光色素と蛋白質のサンプルをピペッティングします。(C) 遠心分離前にプレートをシールします。(D) RT-PCR システムにプレートを配置すること。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5:標準 nanoDSF 実験ワークフロー 。(A) ラックを読み込み毛細血管を開きます。(B) ラックに毛細血管を読み込んでいます。(C) 磁気シール ストリップと毛細血管を固定します。(D) 実験をプログラミング。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: RT-PCR システムのユーザー インターフェイスです。TSA 実験がプログラムされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: 塩の画面サンプル データ。(A) リゾチームとラベル無料 nanoDSF 実験のための 350 nm 対 330 nm での蛍光強度の比。サンプルは、塩の画面 (1.5 M – 塩化アンモニウム 0.2 M) の井戸 C7 C12 に対応します。各条件の計算 Tm値プロットに重畳しています。(B) Tm値の概要は、図 7に示したデータから計算されます。(C) 蛍光強度 590 にリゾチームを用いた疎水性敏感なレポーター色素 TSA 実験の nm。図 7Aのようなサンプルは、塩の画面の井戸 C7 C12 に対応します。計算 Tm値はグラフに重なっています。(D) Tm値の概要は、図 7Cに存在するデータから計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8: pH 画面サンプル データ。リゾチームと pH 画面で得られた Tmシフトの概要です。各ポイントを表す主体的条件;同じ pH 値でのポイントが同じ pH で別のバッファー システムです。Tmシフトは、TSA の実験のため 68.0 ° C と ° C、71.9 nanoDSF 実験のコントロール Tmを基準にして計算されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 9: Osmolyte 画面サンプル データ (リゾチーム).リゾチームと osmolyte 画面のラベル無料 nanoDSF 実験から得られた Tm値の概要です。Tm値 (° C) では、コントロールとして水を含んだ井戸 A1 と A2 と比較されます。ヒートマップは比較 ΔTm値に基づいて生成された (青を表す Tm増加と赤 Tm低下)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 10: Osmolyte 画面サンプル データ (タンパク質 X).(A) タンパク質 X と osmolyte スクリーン ラベル無料 nanoDSF 実験から得られた Tm値の概要です。Tm値はコントロールとして水を含んだ井戸 A1 と A2 と比較されます。ヒートマップは比較 ΔTm値に基づいて生成された (青を表す Tm増加と赤 Tm低下)。(よく A9 から得られる nanoDSF B) 曲線 (1 M D-ソルビトール、安定条件) および D1 (10 mM ジピコリン酸、不安定状態)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 11: バッファーの最適化に及ぼす Tm.リゾチームの TSA Tm値 Tmで最大の増加を与えられる各画面の条件と組み合わせます。100 mM 100 mM、MES、pH 4.2, 酢酸の pH 5.6、横 1.5 M アンモニウム硫酸塩として、バッファー システムとして選ばれました。Osmolyte 濃度の osmolyte 画面で見つけられるそれらと同じ: 10 mM 翼 Gly、100 mM ヒポタウリン 50 mM L リジン、D-ソルビトール 1 M。誤差範囲は、六つの複製の標準偏差を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 分子 PDB コード 共同結晶化の頻度 リン酸 PO4 5132 酢酸 法 4521 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic 酸 (MES) MES 1334 トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (トリス) TRS フォン ジャック 1155 ギ酸 FMT 1072 表 1: 蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) エントリのバッファー分子共結晶周波数の概要。144,868 エントリ (18/12/05 現在正解) の合計から PDBsum16を通じて取得されたデータ。 補足情報。してこのファイルをダウンロードするここをクリックして下さい。  補足表 1.してこのファイルをダウンロードするここをクリックして下さい。  補足テーブル 2.してこのファイルをダウンロードするここをクリックして下さい。  補足テーブル 3.してこのファイルをダウンロードするここをクリックして下さい。