How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Daniel Bruce; Emily Cardew; Stefanie Freitag-Pohl; Ehmke Pohl

doi:10.3791/58666

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Biochemistry

Come stabilizzare proteina: stabilità schermi per Thermal Shift saggi e Nano differenziale a scansione fluorimetria nel progetto Virus-X

Published: February 11, 2019

doi:

10.3791/58666

Daniel Bruce¹, Emily Cardew¹, Stefanie Freitag-Pohl², Ehmke Pohl^1,2

¹Department of Biosciences,Durham University, ²Department of Chemistry,Durham University

Summary

Un protocollo è presentato per testare rapidamente la stabilità termica delle proteine in una varietà di condizioni attraverso analisi termica spostamento e nano differenziale a scansione fluorimetria. Sistemi di polmonatura, sali e additivi, insieme che comprende tre schermate di stabilità unica, sono analizzati con le proteine per identificare buffer adatto per studi strutturali e funzionali.

Abstract

Il progetto Horizon2020 Virus-X è stato fondato nel 2015 il Virosfera dei biotopi estremi selezionati per scoprire nuove proteine virali. Per valutare il potenziale valore biotecnico di queste proteine, l’analisi della proteina di strutture e funzioni è una sfida centrale in questo programma. La stabilità del campione della proteina è essenziale per fornire risultati di test significativi e aumentare la crystallizability degli obiettivi. Il dosaggio di spostamento termico (TSA), una tecnica basata sulla fluorescenza, è stabilito come un metodo popolare per ottimizzare le condizioni di stabilità delle proteine nel alto-rendimento. In CST, fluorophores impiegate sono coloranti estrinseche, ecologicamente sensibili. In alternativa, tecnica simile è nano differenziale a scansione fluorimetria (nanoDSF), che si basa sulla fluorescenza nativa della proteina. Presentiamo qui un romanzo osmolyte schermo, uno schermo 96-condizione di additivi organici progettato per guidare i processi di cristallizzazione attraverso esperimenti preliminari di TSA. Insieme a pH precedentemente sviluppato e schermi di sale, il set di tre schermi fornisce un’analisi completa della stabilità proteica in una vasta gamma di sistemi di polmonatura e additivi. L’utilità degli schermi è dimostrato nell’analisi TSA e nanoDSF di lisozima e proteine X, una proteina dell’obiettivo del progetto Virus-X.

Introduction

Molti enzimi biotecnologicamente utile hanno origini virali, come il tabacco etch virus (TEV) proteasi¹ e rhinovirus umano tipo 3C (HRV 3C) proteasi². Horizon2020 Virus-X progetto (Figura 1)³. L’obiettivo di questo programma è (un) per estendere la gamma di proprietà delle famiglie degli enzimi noti e (b) per caratterizzare nuovi enzimi della funzione ancora sconosciuta (enzima X). Determinazione della struttura cristallografica gioca un ruolo fondamentale nella caratterizzazione di proteine bersaglio, in particolare in quei casi dove le sequenze della proteina si sono evoluti di là di riconoscimento⁴. Stabilità delle proteine è un fattore chiave nel processo di cristallizzazione; campioni devono essere conformazionalmente omogenea e strutturalmente sano per un periodo di tempo a forma diffracting cristalli di alta qualità. Inoltre, è indispensabile per analisi di attività le proteine presenti nella loro conformazione attiva, che può essere facilitato anche da un favorevole ambiente molecolare.

Malgrado lo sviluppo nella tecnologia disponibile a cristallografi, cristallizzazione della proteina rimane un molto tempo e laborioso processo empirico⁵. Esperimenti preliminari biofisici per migliorare la stabilità della proteina in soluzione dare chiaramente un punto di partenza migliore per la cristallizzazione della proteina e consumano solitamente solo una relativamente piccola quantità di proteine del campione⁶^,⁷^, ⁸^,⁹. Il gran numero di proteine bersaglio per essere studiati in questo progetto anche l’esigenza di analisi di stabilità scalabile, ad alta velocità. Uno dei metodi più popolari per la caratterizzazione biofisica di pre-cristallizzazione delle proteine è il dosaggio di spostamento termico (noto anche come TSA o fluorimetria, DSF a scansione differenziale)¹⁰^,¹¹.

CST impiegano un colorante fluorescente ambientalmente sensibili per rilevare la denaturazione termica dei campioni della proteina. Molti coloranti comunemente utilizzati hanno attività fluorescenza variabile a seconda della polarità del loro ambiente, spesso visualizzando un output di alta fluorescenza in ambienti idrofobi ma in fase di raffreddamento rapido in ambienti polari¹². Proteine generalmente causano aumenti pronunciati in fluorescenza di tintura come loro nuclei idrofobi essere esposti durante la denaturazione, spesso seguita da una diminuzione della fluorescenza di tintura a temperature molto elevate come proteine cominciano a aggregato (Figura 2).

Mentre un colorante sensibile idrofobicità è spesso una buona scelta per una tintura TSA di uso generale, può essere inadatto per le proteine con grande, esposte al solvente regioni idrofobiche, che mostrano spesso dannosamente alta priorità bassa fluorescenza. Fluorofori con modalità alternative di azione esistano (vedi discussione), ma potrebbe invece essere utile per tenere traccia di denaturazione attraverso la fluorescenza della proteina intrinseca con nanoDSF.

Residui di triptofano che sono sepolti nelle regioni polari di una proteina fluorescente con un massimo di emissione di 330 nm. Come si svolge un campione della proteina e questi residui diventano esposti ad un solvente polare, loro emissione massima subisce un cambiamento di bathochromic a 350 nm¹³. nanoDSF sfrutta questo spostamento in emissione massima per sondare il dispiegarsi di un campione della proteina senza la necessità di fluorofori estrinseca¹⁴.

Sciogliere le curve mostrando passaggi di denaturazione singolo possono essere analizzati inserendo dati a un modello di Boltzmann sigmoidale. La temperatura del punto di flesso della transizione spiegamento (T_m) viene utilizzata come una misura quantitativa della stabilità termica della proteina e un punto di riferimento per confrontare il favorability condizioni diverse.

Curve di fusione della proteina stessa in diverse condizioni a volte possiedono un grado di eterogeneità che possono rendere impraticabile un raccordo sigmoidale di Boltzmann. Per discernere i valori di_m T dai dati che si discosta dalla topologia classico curva, metodi numerici possono essere utilizzati come quelli impiegati in NAMI, un open source TSA dati analisi programma¹¹. Quadri termodinamici alternativi è utilizzabile anche per analizzare le curve più complesse con più passaggi di denaturazione, come ad esempio la metodologia ProteoPlex¹⁵.

Le schermate di stabilità sono state progettate per uso negli esperimenti di TSA e nanoDSF per identificare rapidamente le condizioni favorevoli per una proteina dell’obiettivo (Figura 3, composizioni di schermo sono disponibili nelle informazioni supplementari). Informazioni raccolte con le schermate possono essere utilizzati in molte fasi della pipeline cristallografica, tra cui: campione di deposito; purificazione, minimizzando la perdita di rendimento attraverso la proteina sta svolgendo durante il processo di purificazione; design, funzionalità della proteina nei saggi di attività con stabilizzare termicamente buffer e, infine, cristallizzazione, guida prove razionalmente progettato cristallizzazione di rinforzo di dosaggio.

La scelta di base di sistema tampone idoneo per un campione della proteina è vitale; valori di pH incompatibile possono portare alla disattivazione o denaturazione di una proteina. Tuttavia, la presenza di molecole di co-cristallizzato buffer risolto in un gran numero di strutture di cristallo dei raggi x (tabella 1) potrebbe anche essere indicativa di un effetto stabilizzante che è separato per la regolazione del pH semplice e invece deriva dall’industria chimica caratteristiche della molecola del buffer.

Formulato utilizzando diversi di buffer¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ accanto ad altri sistemi tampone comunemente biologicamente compatibile di buon, lo schermo di pH è studiato per deconvolute l’effetto chimico di una molecola di buffer su stabilità proteica dall’effettivo pH della soluzione risultante. Fornendo tre valori di pH per ogni sistema di buffer e incorporando ridondanza valore pH tra sistemi diversi, lo schermo di pH può identificare sia i valori di pH favorevole e sistemi di polmonatura favorevole per una proteina dell’obiettivo.

La schermata di sale contiene comunemente sali di laboratorio così come chaotropes, chelants, metalli pesanti e agenti riducenti. Lo schermo può dare un’indicazione generale dell’affinità di un campione della proteina per gli ambienti con alta forza ionica, ma ogni sottogruppo dei composti può anche fornire informazioni sulla potenziale struttura di una proteina. Ad esempio, un chelant significativamente destabilizzare una proteina potrebbe essere indicativo di metalli strutturali importanti all’interno del campione. Se il campione è anche fortemente stabilizzato da un catione del metallo all’interno dello schermo, questo può fornire un punto di partenza promettente per ulteriori esperimenti strutturali.

Osmolytes sono composti solubili che influenzano le proprietà osmotiche del loro ambiente. In natura, può essere utilizzati come “chaperoni chimici”, far rispettare il ripiegamento delle proteine disordinate e stabilizzazione loro, soprattutto in condizioni di stress²⁰^,²¹^,²². Queste caratteristiche li rendono attraenti additivi in cristallografia di proteine; utilizzabile come crioprotettori durante la raccolta di cristallo, montaggio e stoccaggio processi²³. Uso potenziale dei osmolytes si estende anche alla purificazione delle proteine. Una percentuale significativa di proteine ricombinanti espresse in e. coli può essere insolubile e difficile da recuperare allo stato nativo con metodi di purificazione standard. Osmolytes può essere utilizzato per stabilizzare e proteine da frazioni insolubili di salvataggio, crescente purificazione produce²⁴.

Lo schermo di osmolyte è stato progettato utilizzando stabiliti composti presenti nel Protein Data Bank voci²⁵ e nel database di²⁶ Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated vie (DEOP) e ottimizzato in modo iterativo utilizzando proteine standard. Lo schermo è costruito intorno otto sottoclassi di osmolyte: glicerolo, zuccheri e polioli, non detergente sulfobetaines (NDSBs), Betaine e loro analoghi, organofosfati, dipeptidi, aminoacidi e loro derivati e un gruppo vario finale. Ogni osmolyte è presente in concentrazioni più basate sulla sua solubilità e gamme di concentrazione efficace per il confronto.

Protocol

1. preparazione del campione della proteina Formulare le schermate di stabilità come 500 aliquote µ l in blocchi di 96 pozzetti e guarnizione per deposito. Trasferire 10 µ l di ciascuna condizione di uno schermo di stabilità nella corrispondente bene di una piastra a 96 pozzetti usando una pipetta multicanale per risparmiare tempo (Figura 4A). Preparare 1 mL di una soluzione di circa 1 mg mL-1 della proteina in un sistema di buffer appropriato. Mentre la composizione di un amplificatore adatto varia con ogni campione della proteina, un buon buffer primo di provare è il fosfato di sodio di 10 mM con NaCl 100 mM, pH 7,2.Nota: Le concentrazioni di proteina accettabile variano caso per caso, ma intervalli di concentrazione di 0,5 – 5 mg mL-1 in genere producono curve analyzable. Diluire buffer sono raccomandati per l’uso con le schermate di stabilità per evitare gli effetti di ciascuna condizione di mascheramento. Buffer tipiche composizioni sono circa 10 mM di tampone con circa 100 mM NaCl. Se si esegue un esperimento TSA, aggiungere SYPRO Orange colorante per il campione della proteina ad una concentrazione finale di 20x. Mescolare per inversione o breve Vortex. Trasferire 10 µ l della soluzione della proteina in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti preparata nel passaggio 1.1 (Figura 4B). Sigillare e centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 2 min a 600 x g per assicurarsi la componente proteica del campione e lo schermo sono mescolati (Figura 4C). Lo schermo di stabilità blocco pozzo profondo per richiudere e sigillare e conservare lo schermo a 4 ° C fino a 4 mesi. Conservare lo schermo sale nell’oscurità, in quanto alcuni componenti sono fotosensibili. Se si esegue un esperimento di nanoDSF, procedere al passaggio 2. Se si esegue un esperimento TSA, andare al passaggio 4. 2. preparare un esperimento di nanoDSF Assicurarsi che l’apparecchiatura sia pulito, prestando particolare attenzione a qualsiasi polvere vicino il rack del campione. Se il sistema dispone di uno specchio di retrodiffusione, pulirlo utilizzando etanolo e un tessuto privo di lanugine. Aprire il cassetto di esempio premendo il pulsante di Apertura cassetto . (Figura 5A). Caricare i capillari con circa 10 µ l da ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti di toccante un’estremità del capillare nella soluzione, poi metterli nei corrispondenti supporti capillari del rack del campione (Figura 5B). Fare attenzione a non contaminare la metà dei capillari con le impronte digitali, ecc., in quanto questo potrebbe interferire con le letture di fluorescenza in tutto l’esperimento. Immobilizzare i capillari con la bandella di protezione magnetica (Figura 5C). 3. programmazione di un esperimento di nanoDSF Lanciare una scansione preliminare per rilevare la posizione e l’intensità di ogni capillare premendo il pulsante Avvia scansione scoperta nella scheda Individuazione analisi aumento o diminuzione della forza di eccitazione incidente da una potenza iniziale del 10% entro il picco di ogni scansione capillare è tra 4.000-12.000 unità(Figura 5). Per assicurare il campione viene piegato e sufficientemente concentrato, è consigliabile una scansione iniziale fusione con una pendenza di temperatura. Nella scheda Analisi di fusione , programma una fusione scansione impostando l’opzione Pendenza di temperatura su 7,0 ° C min-1, Iniziare a temperatura di 25 ° C e Temperatura finale a 95 ° C, quindi lanciare il nanoDSF sperimentare premendo il Avviare la fusione pulsante. Se la conseguente fusione curve non mostrano un punto di flesso rilevabile, considerare concentrando ulteriormente il campione o il controllo se la proteina è piegata correttamente. Ripetere i passaggi da 2.1-2.4 per preparare i campioni per un esperimento completo. Nella scheda Analisi di fusione , programma una fusione scansione impostando l’opzione Pendenza di temperatura a 1,0 ° C min-1, Iniziare a temperatura di 25 ° C e Temperatura finale a 95 ° C, quindi lanciare il nanoDSF sperimentare premendo il pulsante Start di fusione . 4. esecuzione di un esperimento TSA Aprire il cassetto di campione premendo saldamente il rientro sul lato destro del cassetto. Collocare il vassoio di 96 pozzetti nel sistema RT-PCR con pozzetto A1 in retro a sinistra (Figura 4D). Fare clic sul pulsante Nuovo esperimento per iniziare a impostare un esperimento TSA. Nella scheda Proprietà di sperimentare , fare clic sull’opzione di Fondere curva quando chiesto che tipo di esperimento si desidera impostare? e l’altra opzione quando chiesto quali reagenti si desidera utilizzare per rilevare la sequenza bersaglio? Nella piastra Setup / definire obiettivi e campioni scheda, immettere un nome di destinazione quindi impostare Reporter come ROX e Quencher come nessuno. Nella piastra Setup / assegnare obiettivi e campioni scheda, assegnare ogni pozzetto della piastra 96 pozzetti per il nome di destinazione inserito nel passaggio precedente. Nella stessa scheda, impostare selezionare la tintura da utilizzare come il riferimento passivo come nessuno. Nella scheda Esecuzione di metodo , è necessario eliminare passaggi fino a quando c’è un totale di tre. Impostare il primo passo a 25,0 ° C, rampa tasso 100%, tempo di 00:05; il secondo passo a 95,0 ° C, tasso di rampa 1%, ora 01:00; il terzo passo per 95,0 ° C, rampa tasso 100%, ora 00:05. Scegliere di raccogliere i dati utilizzando il menu a discesa di Raccolta di dati o premendo l’icona di Raccolta dei dati (Figura 6). Impostare il Volume di reazione di ogni pozzetto a 20 µ l. Premere il pulsante Start Esegui per iniziare l’esperimento TSA. 5. analisi dei dati Scegli una lunghezza d’onda per tracciare una curva di fusione con. Per esperimenti di nanoDSF, il rapporto di intensità di fluorescenza a 330 nm e 350 nm (corrispondente al triptofano in ambienti polari e non polari, rispettivamente)13 è comunemente usato. Per la maggior parte delle CST, l’emissione di tintura massima è adatto per la stampa della curva di fusione (il massimo di emissione di SYPRO Orange è 569 nm)12. Calcolare i valori dim T di ciascuna condizione di determinare i punti di inflessione di ogni curva di fusione. Maggior parte dei sistemi nanoDSF calcola automaticamente i valori dim T di differenziazione numerica delle curve di fusione dopo acquisizione dati. Se il software utilizzato non calcola automaticamente i valori dim T, software libero, alternativo basate su GUI come NAMI11 possibile automatizzare l’analisi dei dati e a valle di lavorazione, dando la possibilità di produrre un heatmap riassuntiva Tm valori per l’intero esperimento di 96 pozzetti (il riferimento di accompagnamento fornisce indicazioni e risorse per l’elaborazione di dati con NAMI). Confrontare i valori dim T di tutte le condizioni di intervistati. Le schermate di stabilità contengono due pozzi in ogni schermata (A1 e A2) che contengono solo acqua. Prendendo i valori di sola acqua come un punto di riferimento permette il calcolo di valori dim ΔT, indirizzamento errori sistematici e consentendo facile confronto tra gli effetti di stabilizzazione. I valori dim T superiori indicano condizioni termicamente stabilizzante raccomandati per l’uso a valle. Promettenti condizioni spesso mostrano una dipendenza di concentrazione nella loro stabilizzazione.

Representative Results

Lisozima è stato analizzato con gli schermi di stabilità e proteina X, una proteina dell’obiettivo del progetto di Virus-X, è stato analizzato con lo schermo di osmolyte. Entrambe le proteine generalmente prodotte fondono le curve con transizioni di denaturazione chiaramente definiti in esperimenti sia TSA e nanoDSF (Vedi figure per le curve rappresentative di accompagnamento). In alcuni casi dove i campioni che hanno fatto non produrre curve interpretabile con una transizione di denaturazione definiti sono stati interpretati come confronti Tm denaturati e non inclusi in. La figura 7 Mostra i risultati dei campioni dalla schermata sale, esemplificando la proprietà di stabilizzare termicamente di cloruro di ammonio verso lisozima. Dipendenze di concentrazione come quella mostrata sopra spesso sono indicative delle condizioni promettente, ma può essere utile confrontare i risultati di crescente concentrazione di ioni con parecchi sali diversi per vedere se la stabilizzazione termica presenta generalmente da un aumento della forza ionica del tampone o se la presenza di ioni specifici conferisce maggiore stabilità. Confronto dei valori dim T di lisozima con lo schermo di pH (Figura 8) rivela due tipi di informazioni. In primo luogo, c’è una tendenza generale di aumento di stabilità con diminuendo i valori di pH. In secondo luogo, i valori dim gamma di T ottenuti utilizzando buffer diversi sistemi con valori di pH identico possono essere significativi. Dati nella Figura 8 suggeriscono che l’accordo tra TSA e nanoDSF in questo esperimento è generalmente buono, ma nanoDSF Mostra una tendenza a identificare i valori dim T leggermente superiori e leggermente più grande Tm sposta di TSA. Tuttavia, alcuni pozzi con valori di pH superiori a 8,5 mostrano grandi discrepanze tra i valori dim T ottenuti da TSA e nanoDSF. Differenze potenzialmente potrebbero essere attribuite al meccanismo di denaturazione della proteina a valori di pH diversi; ad esempio, un colorante sensibile idrofobicità potrebbe dare una lettura se regioni idrofobiche di una proteina diventano esposti al solvente significativamente più veloce rispetto all’ambiente delle modifiche di residui del triptofano nella polarità comparativamente basso Tm . Figura 9 Mostra una mappa di concentrazione di Tm i valori ottenuti con lisozima utilizzando la schermata di osmolyte. Condizioni con i più alti aumenti dim T rispetto ai pozzetti dei controlli (pozzetti A1 e A2, contenenti acqua deionizzata) sono di colore blu scuro. Soprattutto stabilizzante condizioni identificate nella Figura 9 sono glicerolo, 1 M D-sorbitolo, ipotaurina 100 mM e 10 mM Ala-Gly (pozzetti A4-A6, A9, E7 e F8, rispettivamente). La figura 10 Mostra una mappa di concentrazione di Tm i valori ottenuti con proteina X. TSA e nanoDSF esperimenti con lo schermo Osmolyte rivelano che la maggior parte di osmolytes testato darà sia un lieve incremento in Tm (all’interno di 1 ° C) o avere un effetto negativo sulla stabilità della proteina di x. In particolare, l’acido dipicolinico ad una concentrazione di 10 mM (ben D1) appare per denaturare il campione a temperatura ambiente. I risultati TSA e nanoDSF identificano rapidamente l’acido dipicolinico come additivo incompatibile per X di proteine che dovrebbero essere evitati quando si lavora con la proteina. Tuttavia, alte concentrazioni di D-sorbitolo e arabinosio (pozzi A9 e B9, entrambi a 1 M), glicerolo e TMAO (pozzetti A4-A6 ed E1, rispettivamente) sono stati identificati come stabilizzare termicamente. Per lisozima, combinazioni di condizioni ottenendo i più alti valori dim T da ogni schermata di stabilità sono stati provati per sonda per un effetto sinergico e combinato. La figura 11 Mostra un generale aumento nei valori dim T come più componenti del sistema tampone (pH, sale e osmolyte) vengono aggiunti. Nel caso di MES, solfato di ammonio e D-sorbitolo, un Tm aumentare grandi come 10 ° C può essere osservata quando sono presenti tutti i componenti rispetto al MES da solo. Figura 11 Mostra che un notevole effetto sinergico può verificarsi quando i singoli componenti di un buffer sono ottimizzati e combinati con le schermate di stabilità. Su una nota più generale, Figura 11 illustra anche la grandezza dei valori dim ΔT che può essere osservato in TSA e nanoDSF esperimenti. La grandezza di ΔTm realizzabile varia significativamente basato sul sistema della proteina, ma qualsiasi valore dim ΔT intorno e sopra i 5 ° C è spesso indicativo di un benefico effetto stabilizzante. Figura 1 : Bioprospecting. Raccolta di campioni da un ambiente estremo nel progetto Virus-X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: schema TSA. Esempio con annotazioni di una curva di fusione tipici ottenuta da un esperimento TSA. Questa curva è caratteristica del classica “due stati” proteina svolgimento, dove il campione di popolazione transizioni da piegato a denaturato senza rilevabili intermedi parzialmente piegato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3 : Stabilità schermi del flusso di lavoro. Flusso di lavoro standard di ottimizzazione di buffer utilizzando le schermate di stabilità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 : Flusso di lavoro di livello TSA sperimentare con gli schermi stabilità. Da sinistra a destra: (A) aliquote di pipettaggio delle schermate di stabilità in una piastra a 96 pozzetti. (B) pipettaggio campione della proteina con colorante fluorescente all’interno della piastra. (C) la piastra prima centrifugazione di tenuta. (D) Posizionare la piastra in un sistema di RT-PCR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: flusso di lavoro di un esperimento di standard nanoDSF. (A) apertura capillare di cremagliera di caricamento. (B) caricando i capillari nel rack. (C) immobilizzare i capillari con la bandella di protezione magnetica. (D) un esperimento di programmazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6 : Interfaccia utente per il sistema di RT-PCR. Un esperimento TSA è stato programmato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 7 : I dati di esempio di schermata di sale. (A) rapporto di intensità di fluorescenza a 350 nm vs 330 nm per un esperimento di nanoDSF privo di etichetta con lisozima. Campioni corrispondono ai pozzetti C7-C12 dello schermo sale (1,5 M – cloruro di ammonio 0,2 M). I valori dim T calcolati per ogni condizione si sovrappongono sulla trama. (B) sintesi dei valori dim T calcolato dai dati presentati in Figura 7A. Intensità di fluorescenza (C) a 590 nm per un esperimento TSA con lisozima con un colorante sensibile idrofobicità reporter. Come Figura 7A, i campioni corrispondono ai pozzetti C7-C12 della schermata di sale. I valori dim T calcolati si sovrappongono sul grafico. (D) sintesi di Tm valori calcolati dai dati presenti in Figura 7C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 8: i dati di esempio di schermo pH. Riepilogo di Tm turni ottenuti con lisozima e lo schermo di pH. Ogni punto rappresenta una condizione indipendente; sistemi di polmonatura diversi presso il pH stesso sono punti lo stesso valore di pH. Tm turni vengono calcolati rispetto un controllo Tm 68,0 ° C per TSA esperimenti e 71,9 ° C per gli esperimenti nanoDSF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 9 : I dati di esempio Osmolyte schermo (lisozima). Riepilogo di Tm valori ottenuti da un esperimento di nanoDSF privo di etichetta con lisozima e ciascun pozzetto dello schermo osmolyte. I valori dim T (in ° C) vengono confrontati con i pozzetti A1 e A2 che contengono acqua come un controllo. Un heatmap è stato generato in base ai valori dim ΔT rispetto (blu denota un aumento di Tm e rosso una diminuzione dim T). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 10: i dati di esempio di schermo (proteina X) Osmolyte. (A) sintesi di Tm valori ottenuti da un esperimento di nanoDSF privo di etichetta con proteina X e lo schermo osmolyte. Tm valori vengono confrontati nei pozzetti A1 e A2 che contengono acqua come un controllo. Un heatmap è stato generato in base ai valori dim ΔT rispetto (blu denota un aumento di Tm e rosso una diminuzione dim T). (B) nanoDSF curve ottenute da ben A9 (1 M D-sorbitolo, una condizione di stabilizzazione) e D1 (acido dipicolinico 10 mM, una condizione destabilizzante). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 11 : Tampone effetto di ottimizzazione su Tm. I valori dim TSA T di lisozima combinati con le condizioni di ogni schermo quello offerto il più grande aumento in Tm. 100 mM a pH acido acetico, pH 4.2 e 100mm MES, 5.6, sono stati scelti come i sistemi di polmonatura, al fianco di solfato di ammonio di 1,5 M come il sale. Osmolyte concentrazioni erano identiche a quelli trovati nella schermata osmolyte: 10mm Ala-Gly, 1m D-sorbitolo, 50mm L-lisina e 100mm ipotaurina. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di sei repliche. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Molecola PDB Code Frequenza di co-cristallizzazione Fosfato PO4 5132 Acetato ATTO 4521 -(N-Morpholino) 2-Ethanesulfonic acido (MES) MES 1334 Tris (idrossimetil) amminometano (tris) TRS 1155 Formiato di FMT 1072 Tabella 1: sintesi di frequenza di co-cristallizzazione di molecola buffer nelle voci di Protein Data Bank (PDB). Dati ottenuti attraverso PDBsum16 da un totale di 144.868 voci (aggiornate al 05/12/18). Informazioni supplementari. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare nella tabella 1. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 2. Per favore clicca qui per scaricare questo file. Complementare tabella 3. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

Aspetti critici nell’ambito del protocollo includono la centrifugazione e la corretta tenuta della piastra 96 pozzetti per esperimenti di TSA (punto 1.5). Centrifugazione assicura che la condizione di campione e schermo di proteine entrano in contatto e mescolare. Inoltre, se un piatto non sealed viene utilizzato per un esperimento TSA, c’è un rischio significativo di solvente evapora in tutto l’esperimento, provocando un aumento della concentrazione del campione e aumentando le possibilità di aggregazione proteica prematura.

CST e nanoDSF sono favorevoli a una vasta gamma di campioni proteici; la maggior parte dei campioni può produrre curve di fusione interpretabile con una tintura a base di idrofobicità reporter o attraverso nanoDSF privo di tintura. Se fonti di fluorescenza standard non sono adatti per la vostra proteina, la più semplice modifica del protocollo che potrebbe essere esplorato è la scelta del fluoroforo. Diversi coloranti alternativi potrebbero essere adatti per esperimenti TSA. Gli esempi includono N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), un composto che reagisce in dopo reagisce con un tiolo²⁷e 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), un composto che varia la sua fluorescenza sulla base del rigidità del suo ambiente, aumentando la sua fluorescenza come un campione della proteina si svolge il²⁸^,²⁹ (la tintura di quest’ultima richiede spesso alte concentrazioni del campione).

Metodi alternativi di analisi della curva di fusione sono disponibili se T_m non viene calcolato automaticamente dal software dello strumento. Se dati sono omogenei e un solo punto di denaturazione è ravvisabile nelle curve della fusione, un set di dati troncati può essere montato su un sigmoideo con la seguente equazione di Boltzmann:

Dove F è l’intensità di fluorescenza a temperatura T, F_min e F_max sono le intensità di fluorescenza prima e dopo la transizione di denaturazione, rispettivamente, T_m è la temperatura del punto medio della transizione di denaturazione e C è la pendenza a T_m. Mentre questo metodo funziona bene per i processi di denaturazione in due semplici passaggi, è inadatto per le curve di fusione complessa con transizioni multiple.

Uno dei principali vantaggi di TSA è la sua accessibilità; Esperimenti TSA possono essere eseguiti in qualsiasi sistema di RT-PCR con filtri a lunghezze d’onda adatto per la tintura di fluorescenza impiegate. Questa accoppiata con il basso costo dei materiali di consumo, facilità d’uso e relativamente bassa quantità di proteine necessarie, rendere TSA una tecnica importante per una vasta gamma di scale di progetto, sia nell’industria e mondo accademico.

Oltre che indica condizioni di buffer favorevole, le schermate contengono alcuni pozzi che possono dare gli indizii alla presenza di metalli strutturali all’interno di una proteina di campione. Pozzi che potrebbero essere di particolare interesse nella schermata del sale sono G6 e G7, che contengono 5 mM EDTA e 5 mM EGTA, rispettivamente. Destabilizzazione termico significativo in questi pozzi può essere indicativi di importanti ioni metallici nella proteina che sono sequestrati dalla chelants. Composti all’interno dello schermo di osmolyte anche potenzialmente è in grado di fornire indizi per la funzione di una proteina. Molti dei composti nella schermata appartengono a classi di molecole che sono comuni substrati degli enzimi. Per esempio, la stabilizzazione generale accordata dal saccaridi (presenti nei pozzi A11-B10) per lisozima potrebbe essere attribuita a loro somiglianza strutturale alla consolidata substrati dell’enzima, N-acetilglucosamina oligomeri³⁰.

I protocolli TSA e nanoDSF illustrati sopra possono anche essere adattati per studiare le interazioni proteina-ligando. Ligandi che si legano specificamente a una proteina possono aumentare la sua stabilità termica introducendo nuove interazioni all’interno del complesso. Un cambiamento positivo dose-dipendente nella proteina T_m è un segno promettente di un’interazione proteina-ligando successo. La velocità, la velocità effettiva e il basso costo di screening di librerie di composte con CST ha reso un metodo molto popolare nella scoperta della droga di fase iniziale.

Ottimizzando le condizioni di buffer di proteine bersaglio e loro complessi ligando può essere essenziale per il successo di un progetto, come dimostrano i numerosi esempi di letteratura³¹^,³²^,³³^,³⁴. Con un’analisi tipica con meno del 2 h compreso il tempo di setup, CST e nanoDSF accoppiato con schermi di stabilità rappresentano una tecnica veloce, poco costoso per le ottimizzazioni di buffer.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell’ambito del programma ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea (accordo di finanziamento n ° 685778). Questo lavoro è stato supportato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC, grant numeri 1/M011186/BB, BB/J014516/1). DB grazie dal BBSRC dottorato formazione partenariato Newcastle-Liverpool-Durham per una borsa di studio e Durham University Dipartimento di bioscienze per contribuire verso il finanziamento di questo lavoro. Ringraziamo Ian Edwards per il suo aiuto e dipartimento della Durham University Dipartimento di spettrometria di massa chimica per la loro analisi strumentale della proteina X. Siamo grati a Arnthor Ævarsson per il suo lavoro con il progetto Virus-X e grazie anche a Claire Hatty e NanoTemper GmbH per il prestito e ad assistere con il sistema Prometeo NT.48 per questo progetto. Infine, grazie a Frances Gawthrop e Tozer semi per il loro supporto nell’ambito del premio iCASE BBSRC.

Materials

Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (T_m and T_onset), critical denaturant concentrations (C_m), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (T_agg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml^-1).

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Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project. J. Vis. Exp. (144), e58666, doi:10.3791/58666 (2019).

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