How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Daniel Bruce; Emily Cardew; Stefanie Freitag-Pohl; Ehmke Pohl

doi:10.3791/58666

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Biochemistry

Wie Protein zu stabilisieren: Stabilität-Bildschirme für thermische Verschiebung Assays und Nano-Differential Scanning Fluorimetry in den Virus-X-Projekt

Published: February 11, 2019

doi:

10.3791/58666

Daniel Bruce¹, Emily Cardew¹, Stefanie Freitag-Pohl², Ehmke Pohl^1,2

¹Department of Biosciences,Durham University, ²Department of Chemistry,Durham University

Summary

Ein Protokoll wird präsentiert, um schnell die thermische Stabilität von Proteinen in einer Vielzahl von Bedingungen durch thermische Verschiebung Assays und Nano differential scanning Fluorimetry testen. Puffersysteme, Salze und Zusatzstoffe, zusammen sind bestehend aus drei einzigartige Stabilität Bildschirme mit Proteinen zu identifizieren geeignete Puffer für funktionelle und strukturelle Studien untersucht.

Abstract

H2020 Virus-X-Projekt entstand im Jahr 2015 zu den Virosphere ausgewählten extreme Biotope entdecken neue virale Proteine. Um den potenziellen biotechnische Wert dieser Proteine, die Analyse des Proteins zu bewerten ist Strukturen und Funktionen eine zentrale Herausforderung in diesem Programm. Die Stabilität des Proteins Probe unbedingt aussagekräftige Untersuchungsergebnisse und erhöhen die Crystallizability der Ziele. Die thermische Verlagerung Assay (TSA), eine Fluoreszenz basierende Technik ist als eine beliebte Methode zur Optimierung der Bedingungen für die Proteinstabilität im Hochdurchsatz-etabliert. TSA sind die eingesetzten Fluorophore extrinsische, ökologisch empfindlichen Farbstoffen. Eine Alternative ist ähnliche Technik Nano differential scanning Fluorimetry (NanoDSF), die auf native Fluoreszenz Protein angewiesen ist. Wir stellen Ihnen hier einen neuartige Osmolyte Bildschirm, ein 96-Zustand des organischen Zusätze zur Kristallisation Studien durch TSA Vorversuchen zu führen. Zusammen mit zuvor entwickelten pH-Wert und Salz Bildschirme bietet der Satz von drei Bildschirmen eine umfassende Analyse der Proteinstabilität in einer Vielzahl von Puffersysteme und Zusatzstoffen. Das Dienstprogramm der Bildschirme zeigt sich in der TSA und NanoDSF Analyse von Lysozym und Protein X, ein Zielprotein des Projekts Virus-X.

Introduction

Viele biotechnologisch nützlich Enzyme stammen aus viralen Quellen, wie z. B. der Tabak Ätzen Virus (TEV) Protease¹ und menschlichen Rhinovirus Typ 3 C (HRV 3 C) Protease². Die H2020 Virus-X Projekt (Abbildung 1)³. Ziel dieses Programms ist (a) die Eigenschaften der bekannten Enzym Familien zu erweitern und (b) neuartige Enzyme noch unbekannter Funktion (Enzym-X) zu charakterisieren. Kristallographische Strukturbestimmung spielt eine zentrale Rolle im Ziel Protein Charakterisierung, insbesondere in jenen Fällen, wo die Proteinsequenzen über Anerkennung⁴entwickelt haben. Proteinstabilität ist ein Schlüsselfaktor bei der Kristallisation; Proben müssen über einen bestimmten Zeitraum hinweg in Form qualitativ hochwertige, Interferenzgitters Kristalle conformationally homogen und strukturell stichhaltig sein. Darüber hinaus ist es wichtig für Aktivität-Assays, die die Proteine in ihrer aktiven Konformation vorhanden sind, die auch durch ein günstiges molekularen Umfeld gefördert werden kann.

Trotz der Entwicklung in der Technologie zur Verfügung, um Kristallographen bleibt Protein Kristallisation eine zeitraubende und arbeitsintensive empirischen Prozess⁵. Biophysikalische Vorversuchen zur Verbesserung der Proteinstabilität in Lösung geben eindeutig einen besserer Ausgangspunkt für Protein Kristallisation und verbrauchen in der Regel nur eine vergleichsweise kleine Menge Protein Probe⁶^,⁷^, ⁸^,⁹. Die große Zahl der Zielproteine in diesem Projekt untersucht werden erfordert auch skalierbar, Hochdurchsatz-Stabilität-Assays. Eine der beliebtesten Methoden für Pre-Kristallisation biophysikalische Charakterisierung der Proteine ist die thermische Verlagerung Assay (auch bekannt als TSA oder Differential scanning Fluorimetry, DSF)¹⁰^,¹¹.

TSA beschäftigen eine ökologisch-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff thermische Denaturierung der Proteinproben verfolgen. Viele häufig verwendete Farbstoffe haben Variable Fluoreszenz Aktivität je nach Polarität ihrer Umgebung, oft eine hohe Fluoreszenz-Ausgabe in hydrophobe Umgebungen anzeigen aber durchläuft zur Zeit raschen Abschrecken in polaren Umgebungen¹². Proteine verursachen in der Regel ausgeprägte Erhöhungen Farbstoff Fluoreszenz, da ihre hydrophobe Kerne, während Denaturierung ausgesetzt werden, oft gefolgt von einem Rückgang der Farbstoff Fluoreszenz bei sehr hohen Temperaturen wie Proteine zu aggregieren (Abbildung 2) beginnen.

Hydrophobie-Sensitive Farbstoff ist, zwar häufig eine gute Wahl für eine allgemeine Verwendung TSA Farbstoff lässt ungeeignet für Proteine mit großen, Lösungsmittel ausgesetzt hydrophobe Regionen, die oft nachteilig hohe Hintergrundfluoreszenz aufweisen. Fluorophore mit alternativer Wirkmechanismen existieren (siehe Diskussion), aber es kann stattdessen wünschenswert, Denaturierung durch intrinsische Protein Fluoreszenz mit NanoDSF zu verfolgen sein.

Tryptophan-Rückstände, die in unpolaren Regionen eines Proteins begraben sind fluoreszieren mit einer Emission maximal 330 nm. Da diese Rückstände ein polares Lösungsmittel ausgesetzt oder ein Protein-Muster entfaltet, erfährt ihre maximale Emission eine Bathochromic Verschiebung bis 350 nm¹³. NanoDSF nutzt diese Verschiebung in der Emission maximal bis zu sondieren, die Entfaltung einer Protein-Probe ohne extrinsische Fluorophore¹⁴.

Schmelzen Sie Kurven zeigen einzelne Denaturierung Schritte durch den Einbau von Daten zu einem Boltzmann sigmoidale Modell analysiert werden können. Die Temperatur an den Wendepunkt des sich entfaltenden Übergangs (T_m) dient als ein quantitatives Maß für Protein thermische Stabilität und ein Benchmark Favorability von verschiedenen Bedingungen zu vergleichen.

Schmelze Kurven des gleichen Proteins unter verschiedenen Bedingungen besitzen manchmal einen Grad der Heterogenität, die eine Boltzmann sigmoidale Einbau unmöglich machen kann. Um T-_m -Werte aus den Daten zu erkennen, die von der klassischen Kurve Topologie abweicht, können numerische Methoden wie die Beschäftigten in NAMI, eine OpenSource-TSA Daten Analyse Programm¹¹verwendet werden. Alternative thermodynamischen Frameworks können auch genutzt werden, um komplexere Kurven mit mehreren Denaturierung Schritten, wie die ProteoPlex Methodik¹⁵zu analysieren.

Die Stabilität-Bildschirme wurden für den Einsatz in TSA und NanoDSF Experimente entwickelt, um schnell günstige Bedingungen für ein Zielprotein identifizieren (Abbildung 3, Bildschirm Kompositionen sind in den Zusatzinformationen). Mit den gesammelten Informationen kann in vielen Phasen der kristallographischen Pipeline einschließlich verwendet werden: Probieren Sie Lagerung; Reinigung, Minimierung von Ertragsverlusten durch Protein entfaltet während des Reinigungsprozesses; Test-Design, Stärkung der Protein-Funktionalität in Aktivität Assays mit thermisch stabilisieren, Puffer und schließlich Kristallisation, Führung rational gestalteten Kristallisation Studien.

Die Wahl einer geeigneten Puffer System Basis für eine Protein-Probe ist entscheidend; inkompatible pH-Werte führen zu die Deaktivierung oder Denaturierung eines Proteins. Jedoch könnte die Anwesenheit von Co kristallisierten Puffer Moleküle aufgelöst in eine große Anzahl von x-ray Kristallstrukturen (Tabelle 1) auch eine stabilisierende Wirkung hindeuten, das separate, einfache pH-Wert Regulierung und stattdessen ergibt sich aus der chemischen Funktionen des Moleküls Puffer.

Formuliert mit mehreren gut Puffer¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ neben anderen allgemein biologisch kompatiblen Puffersysteme, die pH-Bildschirm soll die chemische Wirkung eines Puffer-Moleküls auf deconvolute Proteinstabilität aus der tatsächlichen pH-Wert der erhaltenen Lösung. Durch drei pH-Werte für jedes Puffersystem und Einbeziehung pH Wert Redundanz zwischen den verschiedenen Systemen, kann der pH-Wert-Bildschirm günstige pH-Werte und günstige Puffersysteme für ein Zielprotein identifizieren.

Die Salz-Bildschirm enthält häufig Labor Salze sowie Chaotropes, Chelants, Schwermetalle und Reduktionsmittel. Der Bildschirm kann eine allgemeine Angabe der Affinität einer Protein-Probe für Umgebungen mit hohen Ionischen stärken geben, aber jede Untergruppe der Verbindungen kann auch Auskunft über die mögliche Struktur eines Proteins. Beispielsweise könnte ein Chelator deutlich Destabilisierung eines Proteins wichtigen strukturellen Metallen in der Probe hindeuten. Wenn die Probe durch ein Metall kation innerhalb des Bildschirms auch stark stabilisiert wird, kann dies einen vielversprechenden Ansatzpunkt für weitere bauliche Experimente bereitstellen.

Osmolyten sind lösliche Verbindungen, die die osmotischen Eigenschaften ihrer Umgebung beeinflussen. In der Natur können sie als “chemische Chaperone”, erzwingen die Faltung von Proteinen, ungeordneten und stabilisieren, vor allem in Stress Bedingungen²⁰^,²¹^,²²verwendet werden. Diese Eigenschaften machen sie attraktiv Zusatzstoffe in Proteinkristallographie; verwendbar als Kryoprotektanten während der Kristall-Ernte, Montage und Lagerung verarbeitet²³. Osmolyten mögliche Verwendung erstreckt sich auch auf die Aufreinigung von Proteinen. Ein erheblicher Anteil der rekombinanten Proteinen in E. Coli ausgedrückt kann unlöslich und schwierig in der nativen Zustand mit standard Reinigungsverfahren zu erholen. Osmolyten können verwendet werden, um zu stabilisieren, zu retten und Proteine aus unlöslichen Brüche, zunehmende Reinigung ergibt²⁴.

Der Osmolyte-Bildschirm wurde mit etablierten Verbindungen, die in Protein Data Bank Einträge²⁵ und²⁶ Datenbank Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated Wege (DEOP) konstruiert und mit standard Proteine iterativ optimiert. Der Bildschirm ist rund acht Unterklassen der Osmolyte gebaut: Glycerin, Zucker und Polyole, nicht-Reinigungsmittel-Sulfobetaines (NDSBs), Betaine und deren Analoga, Organophosphate, Dipeptide, Aminosäuren und deren Derivate und eine letzte Diverses Gruppe. Jedes Osmolyte kommt in mehreren Konzentrationen aufgrund seiner Löslichkeit und wirksame Konzentration reicht für den Vergleich.

Protocol

1. Vorbereitung der Protein-Probe Die Stabilität-Bildschirme als 500 µL-Aliquots in 96-Well-Blöcken zu formulieren und Dichtung für die Lagerung. Übertragen Sie 10 µL jeder Bedingung eines Bildschirms Stabilität in das entsprechende gut von einer 96-Well-Platte mit einer Multi-Kanal-Pipette Zeitersparnis (Abb. 4A). 1 mL einer ca. 1 mg mL-1 Proteinlösung in eine geeignete Puffer-System vorbereiten. Während die Zusammensetzung eines geeigneten Puffers mit jedes Protein Sample variiert, ist ein gute erste Puffer zu versuchen 10 mM Natriumphosphat mit 100 mM NaCl, pH 7,2.Hinweis: Akzeptabel Proteinkonzentrationen variieren von Fall zu Fall, sondern Konzentrationsbereiche von 0,5 – 5 mg mL-1 produzieren in der Regel analysierbar Kurven. Verdünnten Puffer sind für die Stabilität Bildschirme empfohlen, Maskierung die Auswirkungen jeder Bedingung zu vermeiden. Typische Pufferzusammensetzungen sind ca. 10 mM Puffer mit ca. 100 mM NaCl. Wenn eine TSA-Experiment durchführen, Hinzufügen der Protein-Probe, eine Endkonzentration von 20 X SYPRO Orange färben. Mischen Sie entweder durch Inversion oder kurz aufschütteln. Übertragen Sie 10 µL der Proteinlösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte in Schritt 1.1 (Abbildung 4B) vorbereitet. Versiegeln und Zentrifugieren der 96-Well-Platte für 2 min bei 600 X g zu gewährleisten, die Protein-Probe und Bildschirm-Komponente werden (Abb. 4C) gemischt. Die Stabilität Bildschirm Tiefbrunnen Block wieder zu verschließen und den Bildschirm bei 4 ° C für bis zu 4 Monate zu speichern. Speichern Sie Salz Bildschirm in der Dunkelheit, da einige Komponenten lichtempfindlich sind. Wenn eine NanoDSF Experiment durchführen, fahren Sie mit Schritt 2. Wenn eine TSA-Experiment durchführen, fahren Sie mit Schritt 4. 2. vorbereiten ein NanoDSF Experiment Stellen Sie sicher, dass das Gerät sauber, wobei besonderes Augenmerk auf Staub in der Nähe der Probenrack. Wenn das System einen backscattering Spiegel hat, mit Ethanol und einem fusselfreien Tuch reinigen. Öffnen Sie die Beispiel-Schublade durch Drücken der Taste Kassenlade öffnen . (Abb. 5A). Laden der Kapillaren mit ca. 10 µL aus jeder Quelle des 96-Well-Platte berühren ein Ende der Kapillare in die Lösung, dann legen Sie sie in die entsprechenden Kapillare Inhaber der Probenrack (Abb. 5B). Achten Sie darauf, die Mitte der Kapillaren mit Fingerabdrücken, usw.verunreinigen., wie dies mit Fluoreszenz-Messungen während des Experiments stören könnten. Die Kapillaren mit der magnetischen Dichtstreifen (Abbildung 5C) zu immobilisieren. 3. Programmierung ein NanoDSF Experiment Starten Sie einen vorläufigen Scan erkennt die Position und die Intensität der jede Kapillare durch Drücken der Taste Start Scan Entdeckung in der Entdeckung Scannen tab. Erhöhung oder verringern die Vorfall Erregung Kraft aus einer Ausgangsleistung von 10 % bis die Höhepunkt der jede Kapillare Scan ist zwischen 4.000-12.000 Einheiten (Abbildung 5D). Damit die Probe gefaltet und ausreichend konzentriert ist, empfiehlt sich ein erste Schmelze Scan mit einem steilen Temperaturgradienten. In der Registerkarte ” Schmelzen Scannen ” experimentieren Programm eine Schmelze scannen, indem Sie die Temperatur Steigung Einstellmöglichkeit auf 7,0 ° C min-1, Start Temperatur bis 25 ° C und Endtemperatur bis 95 ° C, dann starten Sie die NanoDSF durch Drücken der Starten Sie Melting Taste. Wenn die resultierende Schmelze Kurven zeigen keine nachweisbaren Wendepunkt, betrachten die Konzentration der Probe weiter oder prüfen, ob das Protein korrekt gefaltet wird. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.4, die Proben für eine vollständige Experiment vorzubereiten. In der Registerkarte ” Schmelzen Scannen ” experimentieren Programm eine Schmelze scannen, indem Sie die Temperatur Steigung Einstellmöglichkeit auf 1,0 ° C min-1, Start Temperatur bis 25 ° C und Endtemperatur bis 95 ° C, dann starten Sie die NanoDSF durch Drücken die Schaltfläche Beginnen zu schmelzen . 4. Durchführung eine TSA-Experiment Öffnen Sie die Beispiel-Schublade durch den Einzug auf der rechten Seite der Schublade fest drücken. Das 96-Well-Tablett in der RT-PCR-System mit gut A1 nach hinten-links (Abbildung 4D). Klicken Sie auf Neue experimentieren um einrichten ein TSA-Experiment zu beginnen. Klicken Sie im Register Eigenschaften experimentieren Schmelzen Kurve Option gefragt, welche Art von Experiment Sie einrichten möchten? und die andere Option gefragt, welche Reagenzien möchten Sie verwenden, um die Zielsequenz erkennen? In der Platte Setup / definieren Ziele und Proben tab, geben Sie einen Zielnamen dann Reporter als ROX und Quencher Nonefestgelegt. In der Platte Setup / ordnen Ziele und Proben tab, der im vorherigen Schritt eingegeben Zielname jeden Brunnen des 96-Well-Platte zuweisen. In der gleichen Registerkarte Wählen Sie den Farbstoff der passive Referenz dient als keinerfestgelegt. Löschen Sie in der Registerkarte ” Run-Methode ” Schritte erst gibt es insgesamt drei. Den ersten Schritt auf 25,0 ° C, Rampe Rate 100 % Zeit 00:05 gesetzt; der zweite Schritt auf 95,0 ° C, Rampe von 1 %, Zeit 01:00; der dritte Schritt auf 95,0 ° C, Rampe Rate 100 % Zeit 00:05. Für die Datensammlung über das Sammeln von Daten Dropdown-Menü auswählen oder durch Drücken der Datenerhebung -Symbol (Abbildung 6). Stellen Sie Reaktionsvolumen pro Well 20 µL. Drücken Sie die Taste Start ausführen , um die TSA-Experiment beginnen. (5) Datenanalyse Wählen Sie eine Wellenlänge eine Schmelze Kurve mit Plotten. Für NanoDSF Experimente, das Verhältnis von Fluoreszenz-Intensitäten auf 330 nm und 350 nm (entsprechend an Tryptophan in unpolaren und polaren Klimas)13 wird häufig verwendet. Für die meisten TSA, die Farbstoff-Emission maximale eignet sich für Schmelze Kurve Plotten (Emission maximal SYPRO Orange ist 569 nm)12. Berechnen Sie die T-m -Werte jeder Bedingung durch die Bestimmung der Flexion Punkt(e) jeder Schmelze-Kurve. Die meisten NanoDSF Systeme berechnen automatisch T-m -Werte durch numerische Differenzierung der Schmelze Kurven nach der Datenerfassung. Wenn die verwendete Software T-m -Werte nicht automatisch berechnen, kann kostenlose, alternative GUI-driven Software wie NAMI11 automatisieren, Datenanalyse und flussabwärts Verarbeitung, derzufolge eine Heatmap zusammenfassende Tm produzieren Werte für die gesamte 96-Well-Experiment (die begleitende Referenz enthält Anleitungen und Ressourcen für die Datenverarbeitung mit NAMI). Vergleichen Sie T-m -Werte aller Bedingungen befragt. Die Stabilität Bildschirme enthalten zwei Brunnen in jedem Bildschirm (A1 und A2), die nur Wasser enthalten. Die nur mit Wasser Werte als Maßstab nehmen erlaubt die Berechnung der ΔTm -Werte, systematische Fehler zu adressieren und erlaubt einfachen Vergleich von stabilisierenden Wirkungen. Höheren T-m -Werte zeigen thermisch stabilisierende Bedingungen für nachgeschaltete empfohlenen sind. Viel versprechende Bedingungen zeigen oft eine Konzentration Abhängigkeit in ihre Stabilisierung.

Representative Results

Lysozym wurde untersucht, mit der Stabilität-Bildschirmen und Protein X, ein Zielprotein im Virus-X-Projekt wurde untersucht, mit dem Osmolyte-Bildschirm. Beide Proteine in der Regel produziert schmelzen Kurven mit klar definierten Denaturierung Übergänge in TSA und NanoDSF versuchen (siehe begleitende Figuren für repräsentative Kurven). In einigen Fällen, wo die Proben, die nicht produzieren interpretierbaren Kurven mit einem definierten Denaturierung Übergang hat als denaturiert und nicht in Tm Vergleiche interpretiert wurden. Abbildung 7 zeigt Beispiel-Ergebnisse aus dem Salz Bildschirm Veranschaulichung der thermisch stabilisieren Eigenschaften von Ammoniumchlorid in Richtung Lysozym. Konzentration Abhängigkeiten wie oben gezeigt sind oft ein Indikator für vielversprechende Voraussetzungen, aber es kann nützlich sein, vergleichen Sie die Ergebnisse von zunehmender Ionenkonzentration mit mehreren verschiedenen Salzen zu sehen, ob thermische Stabilisierung ergibt sich in der Regel aus einem Erhöhung der Ionenstärke Puffer oder wenn das Vorhandensein von spezifischen Ionen zusätzliche Stabilität verleiht. Vergleich der T-m -Werte von Lysozym mit dem pH-Bildschirm (Abbildung 8) zeigt zwei Stücke von Informationen. Erstens gibt es eine allgemeine Tendenz der Erhöhung der Stabilität mit abnehmendem pH-Wert. Zweitens können die T Angebotm -Werte unter Verwendung verschiedener Puffersysteme mit identischen pH-Werte beträchtlich sein. Daten in Abbildung 8 deuten darauf hin, dass die Vereinbarung zwischen TSA und NanoDSF in diesem Experiment im Allgemeinen gut ist, aber NanoDSF eine Tendenz zeigt zu etwas höheren T-m -Werte zu identifizieren und etwas größeren Tm als TSA verschiebt. Einige Brunnen mit pH-Werten über 8,5 zeigt jedoch große Unterschiede zwischen T-m -Werte von TSA und NanoDSF erhalten. Unterschiede könnte potentiell die Denaturierung Mechanismus des Proteins bei verschiedenen pH-Werten zugeschrieben werden; Beispielsweise könnte ein Hydrophobie-Sensitive Farbstoff eine vergleichsweise niedrige Tm lesen wenn hydrophobe Regionen eines Proteins Lösungsmittel deutlich schneller als die Umgebung von Tryptophan Rückstände Änderungen in der Polarität ausgesetzt werden. Abbildung 9 zeigt eine Heatmap T-m -Werte mit Lysozym mit dem Osmolyte-Bildschirm erhalten. Bedingungen mit der höchsten Tm erhöht im Vergleich zu den Kontroll-Vertiefungen (Brunnen A1 und A2, mit entionisiertem Wasser) sind dunkelblau gefärbt. Besonders stabilisierende Bedingungen identifiziert in Abbildung 9 enthalten Glycerin, 1 M-D-Sorbit, Hypotaurine 100 mM und 10 mM Ala-Gly (Brunnen A4-A6, A9, E7 und F8,). Abbildung 10 zeigt eine Heatmap Tm -Werte, die mit Protein X. TSA und NanoDSF Experimente mit dem Osmolyte-Bildschirm zeigen, dass die Mehrheit der Osmolyten getestet geben entweder eine geringfügige Erhöhung in Tm (innerhalb von 1 ° C) oder eine nachteilige Wirkung auf Protein x Stabilität. Dipicolinic Säure in einer Konzentration von 10 mM (auch D1) scheint vor allem die Probe bei Raumtemperatur zu denaturieren. Die TSA und NanoDSF Ergebnisse identifizieren schnell Dipicolinic Säure als Zusatzstoff nicht kompatibel für Protein-X, die vermieden werden sollten, bei der Arbeit mit dem Protein. Dennoch, hohe Konzentrationen von D-Sorbit und Arabinose (Brunnen A9 und B9, jeweils 1 M) sowie Glycerin und TMAO (Brunnen A4-A6 und E1,) wurden identifiziert als thermisch stabilisiert. Für Lysozym wurden Kombinationen von Bedingungen nachgeben der höchsten T-m -Werte von jedem Bildschirm Stabilität getestet, um für einen kombinierten Synergieeffekt Sonde. Abbildung 11 zeigt einer allgemeinen Erhöhung der in Tm -Werte als weitere Komponenten des Puffersystems (pH-Wert, Salz und Osmolyte) hinzugefügt. Im Falle von MES, Ammoniumsulfat und D-Sorbit, ein T-m so groß wie 10 ° C beobachtet werden kann wenn alle Komponenten vorhanden sind im Vergleich zu MES allein erhöhen. Abbildung 11 zeigt, dass eine spürbare synergistische Wirkung auftreten kann, wenn einzelne Komponenten eines Puffers optimiert und in mit der Stabilität-Bildschirme Kombination. Abbildung 11 zeigt generell auch das Ausmaß der ΔTm -Werte, die in TSA und NanoDSF Experimente beobachtet werden können. Das Ausmaß der ΔTm erreichbare variiert deutlich anhand der Protein-System, aber ΔT-m -Wert, um und über 5 ° C ist oft Anzeichen für eine positive stabilisierende Wirkung. Abbildung 1 : Bioprospektion. Musterkollektion von einer extremen Umgebung im Virus-X Projekt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: TSA Schaltplan. Kommentiertes Beispiel einer typischen Schmelze Kurve aus einem TSA-Experiment gewonnen. Diese Kurve ist charakteristisch für die klassischen “zwei-Staaten” Protein entfaltet, wo die Probe Bevölkerung von wechselt zu denaturierten ohne nachweisbare teilweise gefaltet Zwischenprodukte gefaltet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 : Stabilität Bildschirme Workflow. Standard-Workflow der Puffer Optimierung mithilfe der Stabilität-Bildschirme. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4 : Workflow von einem Standard TSA experimentieren mit der Stabilität Bildschirme. Von links nach rechts: (A) pipettieren Aliquote der Stabilität Bildschirme in einer 96-Well-Platte. (B) pipettieren Protein Probe mit fluoreszierenden Farbstoff in die Platte. (C) Abdichtung der Platte vor Zentrifugation. (D) legen die Platte in eine RT-PCR-System. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Workflow eines Experiments standard NanoDSF. (A) Öffnung der Kapillare laden Rack. (B) laden die Kapillaren in das Rack. (C) Immobilisierung der Kapillaren mit der magnetischen Dichtstreifen. (D) Programmierung ein Experiment. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 6 : User Interface für die RT-PCR-System. Eine TSA-Experiment wurde programmiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 7 : Salz Bildschirm Beispieldaten. (A) Verhältnis von Fluoreszenz-Intensitäten bei 350 nm Vs 330 nm für ein Label-freie NanoDSF-Experiment mit Lysozym. Beispiele entsprechen den Brunnen C7-C12 des Bildschirms Salz (1,5 M – 0,2 M Ammoniumchlorid). Berechnete T-m -Werte für jede Bedingung überlagern sich auf dem Grundstück. (B) Zusammenfassung der T-m -Werte berechnet aus den Daten, die in Abbildung 7dargestellt. (C) Fluoreszenz-Intensitäten bei 590 nm für ein TSA-Experiment mit Lysozym mit einem Farbstoff Hydrophobie-Sensitive Reporter. Wie Abbildung 7Aentsprechen die Proben in die Vertiefungen C7-C12 des Bildschirms Salz. Berechnete T-m -Werte sind in der Grafik überlagert. (D) Zusammenfassung der T-m -Werte berechnet aus den Daten in Abbildung 7Cvorhanden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 8: Probe Bildschirmdaten pH. Zusammenfassung der Tm Schichten mit Lysozym und der pH-Bildschirm erhalten. Jeder Punkt steht für eine unabhängige Bedingung; Punkte auf der gleichen pH-Wert sind verschiedene Puffersysteme bei den gleichen pH-Wert. Tm Schichten sind relativ zu einer Kontrolle Tm 68,0 ° C für TSA Experimente und 71,9 ° C für NanoDSF Experimente berechnet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 9 : Osmolyte Bildschirm Beispieldaten (Lysozym). Zusammenfassung der T-m -Werte aus einem markierungsfreie NanoDSF Experiment mit Lysozym und jede Vertiefung des Bildschirms Osmolyte gewonnen. T-m -Werte (in ° C) sind im Vergleich zu den Brunnen A1 und A2 die Wasser als ein Steuerelement enthalten. Eine Heatmap wurde generiert basierend auf ΔTm -Werte im Vergleich (blau bezeichnet eine Tm Anstieg und Rot eine T-m -Abnahme). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 10: Osmolyte Bildschirm Beispieldaten (Protein-X). (A) Zusammenfassung der Tm Werte aus einem markierungsfreie NanoDSF Experiment mit Protein X und der Osmolyte-Bildschirm. T-m -Werte sind im Vergleich zu Wells A1 und A2 die Wasser als ein Steuerelement enthalten. Eine Heatmap wurde generiert basierend auf ΔTm -Werte im Vergleich (blau bezeichnet eine Tm Anstieg und Rot eine T-m -Abnahme). (B) NanoDSF Kurven gewonnenen gut A9 (1 M D-Sorbit, einem stabilisierenden Zustand) und D1 (10 mM Dipicolinic Säure, eine destabilisierende Zustand). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 11 : Puffer Optimierung Auswirkungen auf Tm. TSA-T-m -Werte von Lysozym in Kombination mit den Bedingungen von jedem Bildschirm, die den größten Zuwachs in Tmgewährt. 100 mM 100 mM MES, Essigsäure und pH 4,2 pH-Wert 5.6, wurden als die Puffersysteme neben 1,5 M Ammoniumsulfat als Salz gewählt. Osmolyte Konzentrationen waren identisch mit denen in der Osmolyte-Bildschirm: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-Sorbit, L-Lysin 50 mM und 100 mM Hypotaurine. Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der sechs Wiederholungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Molekül PDB-Code Häufigkeit der Co-Kristallisation Phosphat PO4 5132 Acetat ACT 4521 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic Säure (MES) MES 1334 Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) TRS 1155 Formiat FMT 1072 Tabelle 1: Zusammenfassung der Puffer Molekül Co Kristallisation Frequenz in Protein Data Bank (PDB) Einträgen. Daten, die durch PDBsum16 von insgesamt 144.868 Einträge (Stand 05.12.18). Zusatzinformationen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Tabelle1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Tabelle 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Tabelle 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Kritische Aspekte innerhalb des Protokolls gehören die Zentrifugationsschritt und einwandfreie Abdichtung des 96-Well-Platte für TSA Experimente (Schritt 1.5). Zentrifugation sorgt dafür, dass den Protein Probe und Bildschirm Zustand in Berührung kommen und mischen. Darüber hinaus wird eine unversiegelte Platte verwendet für ein TSA-Experiment ist ein erhebliches Risiko des Lösungsmittels verdampft während des Experiments, was zu einer Erhöhung in Probenkonzentration und erhöhen die Chance auf vorzeitige Proteinaggregation.

TSA und NanoDSF sind für eine Vielzahl von Proteinproben zugänglich; die überwiegende Mehrheit der Proben kann interpretierbaren Schmelze Kurven mit einem Farbstoff Hydrophobie-basierte Reporter oder durch NanoDSF Farbstoff-frei produzieren. Wenn standard Fluoreszenz Quellen für Ihr Protein nicht eignen, ist die einfachste Änderung des Protokolls, die untersucht werden könnte die Wahl der Fluorophor. Mehrere alternative Farbstoffe könnten für TSA Experimente geeignet. Beispiele dafür sind N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), eine Substanz, die nach der Reaktion mit einem Thiol-²⁷, und 4 – fluoresziert (Dicyanovinyl) Julolidine (DCVJ), eine Substanz, die die Fluoreszenz basierend auf variiert die Steifigkeit der Umgebung, erhöht seine Fluoreszenz als Protein Muster entfaltet²⁸^,²⁹ (die letzteren Farbstoff erfordert häufig hohe Konzentrationen der Probe).

Alternative Methoden der Schmelze Kurvenanalyse sind verfügbar, wenn T_m durch die Gerätesoftware nicht automatisch berechnet wird. Wenn Daten homogen ist und nur eine Denaturierung Schritt zeigt sich in der Schmelze Kurven, kann eine abgeschnittene Dataset eine Boltzmann sigmoid mit der folgenden Gleichung montiert werden:

Wo F ist die Fluoreszenzintensität bei Temperatur T, F_min und F_max sind die Fluoreszenz-Intensität vor und nach dem Übergang Denaturierung bzw. T_m ist der Mittelpunkt Temperatur des Übergangs der Denaturierung und C ist die Steigung bei T_m. Während diese Methode gut für einfache zweistufige Denaturierung Prozesse funktioniert, ist es ungeeignet für komplexe Schmelze Kurven mit mehreren Übergängen.

Einer der Hauptvorteile der TSA ist die Zugänglichkeit; TSA-Experimente können mit Filter bei geeigneter Wellenlängen für die Fluoreszenz-Farbstoff eingesetzt in eine RT-PCR-System durchgeführt werden. Dies gepaart mit der niedrigen Kosten für Verbrauchsmaterialien, einfache Bedienung und relativ geringe Menge an Protein benötigt, TSA eine wertvolle Technik für eine Vielzahl von Projekt Waagen, sowohl in der Industrie und Wissenschaft machen.

Neben günstigen Pufferbedingungen angibt, enthalten die Bildschirme einige Brunnen, die Hinweise auf das Vorhandensein von strukturellen Metallen innerhalb eines Probe-Proteins führen können. Brunnen, die von besonderem Interesse in der Salz-Bildschirm möglicherweise sind G6 und G7, die 5 mM EDTA und 5 mM EGTA, beziehungsweise enthalten. Bedeutende thermische Destabilisierung in diese Vertiefungen kann wichtige Metall-Ionen in das Protein hindeuten, die durch die Chelants abgesondert werden. Verbindungen innerhalb der Osmolyte Bildschirm bieten möglicherweise auch Hinweise auf die Funktion eines Proteins. Viele der Verbindungen in den Bildschirm gehören zur Klassen des Moleküls, die gemeinsame Substrate von Enzymen sind. Zum Beispiel die allgemeine Stabilisierung gewährten Saccharide (vorhanden in Brunnen A11-B10) für ihre strukturelle Ähnlichkeit mit etablierten Substrate des Enzyms, N-Acetylglucosamin Oligomere³⁰Lysozym zugeschrieben werden könnte.

Die TSA und NanoDSF Protokolle, die oben genannten können auch Protein-Ligand-Interaktionen zu untersuchen angepasst. Liganden, die spezifisch an ein Protein binden können die thermische Stabilität erhöhen, durch die Einführung neuer Interaktionen innerhalb des Komplexes. Eine dosisabhängige positive Verschiebung in Protein T_m ist ein vielversprechenden Zeichen einer erfolgreichen Protein-Ligand Interaktion. Die Geschwindigkeit, Durchsatz und niedrige Kosten von screening-zusammengesetzte Bibliotheken mit TSA hat es eine sehr beliebte Methode in der Frühphase Drogeentdeckung.

Optimierung der Pufferbedingungen Zielproteine und ihrer Liganden komplexe kann entscheidend für den Projekterfolg sein, wie viele Literatur Beispiele³¹^,³²^,³³^,^{34 zeigen}. Mit einem typischen Assay unter unter 2 h inklusive Rüstzeit repräsentieren TSA und NanoDSF gepaart mit Stabilität Bildschirme eine schnelle und kostengünstige Technik für Puffer Optimierungen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dieses Projekt wird finanziell vom European Research Council (ERC) Programms der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation (Grant Agreement n ° 685778). Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Biotechnologie und biologische Wissenschaften Research Council (BBSRC, Zuschuss Zahlen BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB Dank der BBSRC Doctoral Training Partnerschaft Newcastle-Liverpool-Durham für eine Zugehörigkeit und Durham Universität Institut für Biowissenschaften für den Beitrag zur Finanzierung dieser Arbeit. Wir danken Ian Edwards für seine Hilfe und der Durham University Department of Chemistry Mass Spectrometry Abteilung für ihre instrumentelle Analytik von Protein-X. Wir sind dankbar für seine Arbeit mit dem Virus-X Projekt und danke auch an Claire Hatty und NanoTemper GmbH Arnthor Ævarsson für Kredite und mit dem Prometheus-NT.48-System für dieses Projekt zu unterstützen. Zu guter Letzt vielen Dank an Frances Gawthrop und Tozer Samen für ihre Unterstützung im Rahmen des BBSRC Hülle Award.

Materials

Lysozyme	Melford Laboratories	L38100	Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme.
The Durham pH Screen	Molecular Dimensions	MD1-101	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Salt Screen	Molecular Dimensions	MD1-102	96-well protein stability screen. See above for contents.
The Durham Osmolyte Screen	Various	#N/A	96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents.
SYPRO Orange	Invitrogen	S6651	Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF.
96-well PCR Plate	Starlab	1403-7700	Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System.
7500 Fast Real-time PCR System	Applied Biosystems	4362143	96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost.
Prometheus NT.48	NanoTemper Technologies	#N/A	Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (T_m and T_onset), critical denaturant concentrations (C_m), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (T_agg) using built-in software.
Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries	NanoTemper Technologies	PR-C002	Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml^-1).

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Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project. J. Vis. Exp. (144), e58666, doi:10.3791/58666 (2019).

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