À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques
Summary
Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.
Abstract
La compréhension des maladies humaines a été considérablement élargie grâce à l’étude de modèles animaux. Néanmoins, histopathologique des modèles expérimentaux doit être aussi rigoureuse que celle appliquée pour les échantillons humains. En effet, tirer des conclusions fiables et précises critique dépend de la qualité de tissu section préparation. Nous décrivons ici un protocole pour l’analyse histopathologique des tissus murins qui implémente plusieurs étapes automatisées au cours de la procédure, de la préparation initiale à l’enrobage de paraffine des échantillons murines. La réduction des variables méthodologiques grâce à la normalisation du protocole rigoureux des procédures automatisées contribue à une plus grande fiabilité globale d’analyse pathologique murine. Plus précisément, ce protocole décrit l’utilisation d’un traitement automatisé et intégration de systèmes robotiques, couramment utilisées pour le traitement des tissus et enrobage de paraffine d’échantillons humains, pour traiter des spécimens murins d’inflammation intestinale. Nous concluons que la fiabilité de l’examen histopathologique des tissus murins est sensiblement augmentée lors de l’introduction de techniques standardisés et automatisés.
Introduction
Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour disséquer les mécanismes pathogènes conduisant à des maladies humaines1,2. Afin d’évaluer la gravité d’une maladie, les chercheurs doivent évaluer l’effet d’un traitement et étudier les variations architecturales cytologiques et histologiques ou le montant de l’inflammation,3. Pour effectuer sur ces modèles expérimentaux, des analyses détaillées histopathologiques sont nécessaires, souvent en comparant des échantillons murins et humains4,5.
En outre, des échantillons humains sont généralement traités et marqués par des installations de base histopathologie et expérimentés pathologistes humaines à travers standardisé critères histopathologiques et méthodes. À l’inverse, tissus murins sont habituellement fixes, intégrées et analysés par des chercheurs ayant une expérience limitée des protocoles histopathologiques. La qualité et la fiabilité de l’examen histopathologique commence par la préparation des coupes de tissus de haute qualité. Plusieurs facteurs contribuent critique pour augmenter ou diminuer la qualité de l’analyse finale, y compris la fixation, macroscopique de sectionnement, de transformation, de paraffine incorporation et incorporation des échantillons6,7.
Tous ces passages impliquant la manipulation de l’échantillon sont soumis à des erreurs manuelles, y compris l’intégration manuelle des échantillons et, dans une moindre mesure, manuel microtome de sectionnement et de coloration. À l’heure actuelle, l’ensemble du processus de préparation de tissus murins pour évaluation histologique repose sur des protocoles qui varient d’un laboratoire à et protocoles manuelles. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre des protocoles standardisés et automatisés pour réduire les erreurs et la variabilité dans l’examen histopathologique murine.
À notre connaissance, nous décrivons ici les premiers protocoles pour tissu entièrement automatisé de traitement et d’incorporation d’évaluation histologique des tissus murins ; Ces sont couramment utilisées dans les unités de pathologie pour les analyses d’échantillons humains. Un exemple concret de la faisabilité de la méthode, un modèle murin d’inflammation intestinale a été analysé, c’est-à-dire, le modèle de colite chronique causée par l’ingestion répétée de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans l’eau potable8 ,9. Ce paramètre expérimental étroitement ressemble à humaine inflammatoire de l’intestin (IBD) les maladies10 car les animaux traités DSS montrent des signes d’inflammation intestinale, par exemple, perte de poids, selles ou diarrhée et raccourcissement de la colon ainsi que la fibrose 8,9,11. Tel qu’observé pour des patients humains IBD, traitement DSS génère une évolution de la maladie complexe. Dans ce contexte, évaluations histologiques complexes sont nécessaires pour comprendre la profonde altération de l’architecture du tissu. Ainsi, la mise en œuvre des protocoles décrits pour augmenter la qualité de préparation d’échantillon peut-être bénéficier des chercheurs en se fondant sur l’interprétation de histologique et immunohistochimique analyse des paramètres expérimentaux murins. Des modèles expérimentaux murins de maladies humaines impliquant des modifications de l’architecture tissulaire, la présence d’infiltration du tissu cellulaire ou d’inflammation dans différents tissus et organes (intestin, cerveau, foie, peau) pourrait utiliser la qualité accrue de la préparation d’échantillons pour examen histopathologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous utilisons différentes étapes automatisées lors de la préparation des tissus murins pour l’analyse histopathologique. Ce protocole vise à fournir des conseils techniques pour augmenter la reproductibilité et la standardisation de l’ensemble du processus, ce qui améliore la qualité globale de l’évaluation finale histopathologique. Nous avons implémenté des instruments automatisés et méthodes pour la préparation et l’incorporation de tissus, couramment utilisés dans des installations de centrales…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le département de pathologie de l’hôpital Policlinico IRCCS, Milan pour le support technique et l’IEO Animal Facility d’assistance dans l’élevage.
Materials
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10X | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1X | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. . A Practical Guide to Frozen Section Technique. , (2010).
- Rosai, J. . Rosai and Ackerman’s Surgical Pathology. , (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
