Tekrarlanabilir dsRNA mikroenjeksiyon ve Oviposition Bioassay sivrisinekler ve evi sinekler
Summary
Bu iletişim kuralı biz standart ve birkaç yıl boyunca belirli miktarda nükleik asitler, sivrisinekler ve evi sinekler hemolymph doğrudan teslim etmek için kullanılan bir mikroenjeksiyon metodoloji açıklar. Bu iletişim kuralı en az enjeksiyon mortalite sonuçları ve ilişkili doz ölçümleri verimlilik sağlar.
Abstract
Sentetik dsRNAs, RNA müdahale, ikna etmek için kullanılan doz bağımlı fenotipik etkileri olabilir. Bu etkilerin dsRNAs nicel olmayan bir yöntem kullanılarak sunulur tanımlamak zordur. Nükleik asit veya diğer kimyasallar bilinen miktarlarda doğru teslimat bileşikler arasında güvenilir karşılaştırma izin veren ve test edilen bileşiğin etkinliğini ölçmek için önemlidir.
Burada genellikle enjeksiyon yaralanma tarafından indüklenen ölümlerinin azaltılması doğru dsRNA, belirli dozlarda teslimini sağlar bir tekrarlanabilir, nicel mikroenjeksiyon protokol sağlamak. Bu değişiklikler rodamine B, mezun olunan enjeksiyon iğne ilavesi içerir ve bir Gelişmiş kurtarma yöntemi Isoe ve Collins ödünç aldım. Bu yöntem doz yanıt hesaplanması sağlar ve bileşikler arasındaki karşılaştırmaları kolaylaştırır. Bu yöntem sürümleri başarıyla üzerinde sivrisinek hem de evi sinekler yaşayan 3 cinsi ribozomal RNA transkript gen susturmak kaynaklanan verimlilik azaltılması değerlendirmek için kullanılmaktadır.
Bu iletişim kuralı küçük böcek mikroenjeksiyon birçok zorlukları azaltmak için stratejiler sağlar. Görsel doğrulama tarafından eşlik dsRNAs birlikte, mekanik teslim, kimlik’dır etkili yerleşimlerin bir enjeksiyon sonrası iyileşme döneminde dahil olun ve doğru dozaj ve düşük yaralanma mortalite. Bu iletişim kuralı da doğurganlık efektleri tek tip tayini için bir oviposition bioassay açıklar.
Introduction
Nükleik asitler gibi küçük biomolecules yetişkin dipterans için teslim hem Culicidae hem de Muscidae zor olduğu ispatlanmıştır. Oral dsRNAs alımını (sadece genler hedefleme ifade yetişkin testis içinde zaman) kısırlık ve larva Aedes aegypti(SNF7 ve steroid reseptör coactivator hedeflerken) mortalite üretmek için rapor1,2 . Ölüm Ayrıca gözlenen HSP70 larva sinek domesticahedeflerken3. Tür fenotipik etkiler, ancak, Yetişkin Ae. aegypti şeker yemek4,5dsRNA besleme sonra neden olmuş değil.
Mikroenjeksiyon patojenler veya nükleik asitler, böylece bir sistemik yanıt5,6,7,8,9,10 inducing sokarken midgut aşmak için kullanılan . Birçok mikroenjeksiyon tekniği var, otomatik ses teslimi için 2,3 düşük izin mikroişlemci kontrollü enjektörleri enjeksiyon birime görsel ölçüm gerektirir içi üretilen için aygıtlar arasında değişen donanımları içeren nL 5 , 9 , 10 , 11. ribozomal mRNA’ların, hedef RNA müdahale (RNAi) Tetikleyiciler bozabilir eklembacaklılar Rhipicephalus microplus, sığır kene birbirinden çok farklı sivrisinekler Aedes aegypti ve Culex pipiens, yumurtalık geliştirme ve ev sinek sinek domestica5,9,12,13. Bu çalışmalarda oviposition bozulma izleme fenotip fesih veya Döl azalma olarak tezahür gibi inoculant etkinliğini belirlemek için gerekliydi. Bu gibi Wolbachia –geleneksel olmayan biyolojik yöntemlerin çoğu kritik ve istenen yürürlükte erkek giriş (cinsel uyumsuzluk) enfekte ve kısırlık5 RNAi indüklenen multigenerational öldürücü fenotip şeklidir ,9,14. Mortalite ve verimlilik izleme, karakterize ve çok özel biorationals (doğal olarak meydana gelen patojenler ve/veya doğal türevleri)15gelişimi için gereklidir.
Bu iletişim kuralı yetişkin sivrisinek ve evi sinekler için detaylı mikroenjeksiyon teknikleri sunar; Literatürde de anlatılan kez değil bir süreç. Ayrıca, yeterince yetişkin dipterans dsRNA etkileri değerlendirmek için oviposition bioassay yöntemleri açıklanmıştır. Bu protokoller Aedes aegypti ve sinek domestica için özel olarak geliştirilen ancak diğer türler için değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroenjeksiyon dsRNA veya diğer biorationals (Yani, pestisitler, virüsler, microsporidia) teslim edilmesini sağlamak için değerli laboratuvarı bir tekniktir. Birçok laboratuar mikroenjeksiyon yaparlarken, enjekte tutara tam olarak kez nerede teslim edilen birim doğrudan ölçülen11değil iletim sistemi teknik sınırlamaları nedeniyle belirsizdir. Teslim edilen birim ve konsantrasyon EC50 veya IC50 gibi standart toksikolojik önlemler hesaplamasına izin kritik parametreleri veya en az etkili tanımlamak için5,16dozlarda. Burada besleme tarafından teslim her zaman istenen parçacıklara sistemik maruz yol açmaz ve midgut geçiş gerçek doz belirsiz5yetişkin böcekler, RNAi kullanarak fonksiyonel çalışmalar önem kazanır.
Mikroenjeksiyon yordam başlangıçta zor olabilir iken, hızlı ilerleme hızı ve teslimat doğruluk içinde uygulama ve sabır ile elde edilir. Enjeksiyon yordamı mastering zaman yatırım olsa da, başarılı bir kez tekrarlanabilir sonuçlar ve yaralanma mortalite yordamı üretir < % 3. Yeterlilik 300 sivrisinek izin enjeksiyon artırır veya günlük sinekler gibi başarılı enjeksiyon oranı artacak.
Mikroenjeksiyon zorlukların kullanılan iğne nedeniyle çoğu. Uygun kapiller iğne kesme noktası ve uç açısı belirleme yordamı zorlu bir yönüdür ve belirli bir tür için en etkili açılış boyutunu belirlemek için bazı deneme ve hata gerektirir. İnce iğne sivrisinek mikroenjeksiyon (~ 150 µm) için en yararlı hızlı uçar ise tersine, inşaat üstünde uçar (~ 250 µm) daha küçük sivrisinek geniş yaralanma hasara neden açılış büyük iğne içine enjekte hacmin daha büyük teslim etmek için çok küçük ve kabul edilemez enjeksiyon ölüm. Künt bir ucu ile kırık bir iğne genellikle doku hasarı ve artan ölüm olmadan kütikül yoluyla almak zordur. Yani sık sık değiştirilmesi gerekiyorsa çekti birkaç iğne için yararlı böcek ölçekler veya doku parçaları iğneler bir deney boyunca yapışmasına neden olabilir. Biz zor bir iğne yerine yerine sıkışan veya faul iğne temizlemek için deneyin için zaman harcamak daha kolay olduğunu bulduk.
Böylece başarısız enjeksiyonları-ebilmek var olmak çıkarmak (bkz. Adım 2,14-2.15) böcek girerek enjeksiyon çözüm gözlem çok önemlidir. Enjeksiyon çözümleri için rodamine B ek soğuk sahnelenen böcekler uygun dozaj almak ve (bkz. Adım 2.7) pratik yaparken özellikle yararlıdır emin olmak için net görüntü sağlar.
Burada sunulan enjeksiyon ve oviposition bioassay yöntemleri başarıyla gen neden olmuş yetişkin Ae. aegypti ve dsRNAs kullanarak species-specific karşı ribozomal tasarlarken M. domestica devirme ve ölçülebilir fenotipik etkileri Transkript (Şekil 4 ve Şekil 5A). Ayrıca, yeteneği bu yöntemin doğru kişilere microvolumes sunmak için az miktarda malzeme için oluşturulacak doz yanıt eğrileri sağlar (gibi düşük 50 ng; Şekil 5B). Bu Çift Eleme gibi yöntemleri için özellikle yararlı olur veya bu moleküller büyük miktarda üreten dsRNAs, maliyet engelleyici olabilir.
Bu yöntem biyolojik ajanlar (virüs, bakteri, microsporidia) veya kimyasal böcek ilaçları, iğne ile kontrol ettikten sonra herhangi bir teslimat arabellekleri zararsız enjekte etmek için değiştirilebilir. Teslimat birim konsantre boyutunu üreten böcek tarafından sınırlı çözümleri test açısından önemlidir.
Yeterince dsRNA etkinliğini değerlendirmek için öldürücü fenotipleri sadece döl içinde tezahür oviposition izlemek gereklidir. Burada sunulan kadın Ae. aegypti ayrı ayrı blooding sonra holding bireysel debriyaj boyutu belirlenmesi için izin verir ve daha fazla aynı bireyler üzerinde test yapılabilir oviposition (Yani, gen ifade çalışmaları, aşağı üreme çıkış gen ekspresyonu gibi diğer tedbirler ile ilişkilendirmek için ek gonotrophic döngüleri, doku belirli devirme). M. domestica genellikle Hayır Grup yanıt olarak, izole gravid sinekler bırakmaya teşvik çok emek yoğun ve çok sayıda bireyler17için pratik değil gibidir. Bu nedenle, ortalama debriyaj boyutunu belirlemek için bir yöntem sunulur.
Burada sunulan mikroenjeksiyon yöntemi sivrisinek ve evi sinekler için tutarlı sistemik iletir. Ölüm ve biyoanalizler izleme oviposition ile birleştiğinde, bu çok yönlü araçları küçük RNA molekülleri, biyolojik ajanlar ve geleneksel tarım ilaçları transkripsiyon ve fenotipik etkilerini değerlendirmek için oral teslimat uygun olmadığı kullanılabilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hanayo Arimoto (ABD Deniz Kuvvetleri) yazarlar teşekkür, Dana Johnson, Lucy Li ve Roxie beyaz (USDA-ARS) için veri toplama ve analizi ile yardımcı olur. Biz Ayrıca Drs. Pia Olafson (USDA-ARS) ve Ke Wu (University of Florida) el yazması ve Niklaus Hostettler (University of Florida) kritik İnceleme için mikroskop görüntüleri filme için teşekkür ederiz. Finansman USDA tarafından deniz kuvvetleri ve deniz piyadeleri genel sağlık merkezi ve konuşlandırılmış savaş savaşçılar koruma programı WII – 141 C projesi sağlandı. Fon tasarım veya çalışma yönünü veya el yazması gelişimi herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| needle pulling | |||
| vertical pipette puller | Kopf | 720 | settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps |
| glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm | World Precision Instruments | 504949 | capillaries for pulling glass needles |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| microinjector station | |||
| Nanoliter 2010 | World Precision Instruments | NANOLITER2010 | microinjector |
| manual micromanipulator | World Precision Instruments | KITE-L | left hand KITE manipulator |
| magnetic stand | World Precision Instruments | M9 | holds micromanipulator |
| precision stereo zoom binocular microscope on boom stand | World Precision Instruments | PZMIII-BS | dissecting scope for microinjections |
| 1.5X objective | World Precision Instruments | 501377 | objective for microscope |
| light LED ring | World Precision Instruments | 504134 | light ring for injection microscope |
| laboratory chill table | BioQuip Products | 1431 | chill table for microinjections |
| microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | for staging insects while injections |
| Rhodamine B, 98+% | Acros Organics | AC296571000 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| mosquito oviposition bioassays | |||
| large Petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | for holding staging slides |
| plastic cup – 3 1/2 oz. | Dart Container Corporation | TK35 | mosquito oviposition bioassay cups |
| matte tulle fabric | Joanne Fabrics | 1103068 | caps for oviposition bioassays |
| blood source | locally acquired | typically bovine or live chickens | |
| 1 x 30mm clear edible collagen casing | Butcher and Packer | 30D02-05 | |
| heavy weight seed germination paper | Anchor Paper Co | SD7615L | |
| oral aspirator with HEPA filter | John W. Hock Company | 612 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| house fly oviposition bioassays | |||
| 4 L plastic food storage canister | Walmart | 555115143 | |
| 10-inch stockinette sleeve | Medonthego.com | FS15001H | |
| wheat bran | locally acquired | typically found at feed stores | |
| Calf Manna performance supplement | ValleyVetSupply.com | 16731 | pelleted livestock feed |
| dried egg yolk | BulkFoods.com | 40506 | |
| black cotton cloth | locally acquired | typically in craft supplies section | |
| 60 mL cup | Dart Container Corporation | P200-N |
References
- Whyard, S., et al. Silencing the buzz: a new approach to population suppression of mosquitoes by feeding larvae double-stranded RNAs. Parasites & Vectors. 8 (96), (2015).
- Das, S., Debnath, N., Cui, Y., Unrine, J., Palli, S. R. Chitosan, carbon quantum dot, and silica nanoparticle mediated dsRNA delivery for gene silencing in Aedes aegypti: a comparative analysis. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (35), 19530-19535 (2015).
- Tang, T., et al. Stress-induced HSP70 from Musca domestica plays a functionally significant role in the immune system. Journal of Insect Physiology. 58 (9), 1226-1234 (2012).
- Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. Journal of Applied Entomology. 136 (10), 741-748 (2012).
- Estep, A. S., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J. DsRNA-mediated targeting of ribosomal transcripts RPS6 and RPL26 induces long-lasting and significant reductions in fecundity of the vector Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 90, 17-26 (2016).
- Wen, D., et al. N-glycosylation of Viral E Protein Is the Determinant for Vector Midgut Invasion by Flaviviruses. mBio. 9 (1), (2018).
- Liu, Y., Cheng, G., Colpitts, T. Techniques for Experimental Infection of Mosquitoes with West Nile Virus. Methods in Molecular Biology. 1435, 151-163 (2016).
- Puglise, J. M., Estep, A. S., Becnel, J. J. Expression profiles and RNAi silencing of Inhibitor of Apoptosis transcripts in Aedes, Anopheles, and Culex mosquitoes (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 53 (2), 304-314 (2015).
- Sanscrainte, N. D., et al. Reduction in Musca domestica fecundity by dsRNA-mediated gene knockdown. PloS one. 13 (1), e0187353 (2018).
- Isoe, J., Collins, J., Badgandi, H., Day, W. A., Miesfeld, R. L. Defects in coatomer protein I (COPI) transport cause blood feeding-induced mortality in Yellow Fever mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), E211-E217 (2011).
- Drake, L. L., Price, D. P., Aguirre, S. E., Hansen, I. A. RNAi-mediated gene knockdown and in vivo diuresis assay in adult female Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), (2012).
- Kurscheid, S., et al. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Molecular Biology. 10 (1), 20 (2009).
- Kim, M., Sim, C., Denlinger, D. L. RNA interference directed against ribosomal protein S3a suggests a link between this gene and arrested ovarian development during adult diapause in Culex pipiens. Insect molecular biology. 19 (1), 27-33 (2010).
- Atyame, C. M., et al. Comparison of irradiation and Wolbachia based approaches for sterile-male strategies targeting Aedes albopictus. PLoS one. 11 (1), e0146834 (2016).
- Becnel, J. J., Floore, T. G. Introduction to"Biorational Control of Mosquitoes.". Journal of the American Mosquito Control Association. 23, 1-2 (2007).
- Bolognesi, R., et al. Characterizing the mechanism of action of double-stranded RNA activity against western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). PloS one. 7 (10), e47534 (2012).
- Jiang, Y., et al. Semiochemicals from ovaries of gravid females attract ovipositing female houseflies, Musca domestica. Journal of Insect Physiology. 48 (10), 945-950 (2002).
