DsRNA reproducible microinyección y bioensayo de oviposición de mosquitos y moscas de la casa

1. insecto preparación Anestesiar los mosquitos al les refrigeración a 4 ° C durante varias horas o de 2 minutos de exposición a CO2 y a 4 ° C antes de las inyecciones. Frío anestesiar a moscas en 4 ° C 2\u20123 h antes de las inyecciones. Velar que los mosquitos y las moscas están apoyadas si oviposición es una variable de respuesta.Nota: El método de anestesia del mosquito depende de la especie y cepa, por ejemplo, Culex recuperar mucho más rápido de anestesia fría que Aedes aegypti y por lo tanto es preferible CO2 caída. En el hielo, etapa mosquitos o moscas utilizando fórceps suave para apoyarlas ventralmente exponen cuidadosamente en microscopio diapositivas ~0.5 centímetros aparte. Diapositivas estándar pueden contener dos filas de 6 mosquitos o moscas de casa 6-7. Deje un espacio de 1 a 1,5 cm en el extremo derecho o izquierdo de la diapositiva de mosquitos o moscas para facilitar el manejo de diapositivas. Mantener diapositivas de insectos escenificadas a 4 ° C en cajas Petri grande hasta que esté listo para la inyección.Nota: Taladrar un agujero a través de la tapa de la caja de Petri evitará insectos de ser molestado por desplazamiento de aire cuando tapado. Colocar el portaobjetos en un par de tubos capilares de vidrio fijados a la parte inferior del plato facilitará la eliminación de la placa de Petri. 2. insecto inyección Preparar el dsRNA de Estep et al. 5 y Sanscrainte et al. 9. Si libre de contaminantes, dsRNA puede cuantificarse mediante el uso de un espectrofotómetro para medir la absorbancia a 260 nm y calcular la concentración de RNA en μg/mL como un260 × dilución factor × 40. Configurar sobre una mesa chill o cubo de hielo superficial de disección microscopio y microinyector para realizar las inyecciones en los anestesiados por el frío de los mosquitos y moscas (ver paso 1.1 – 1.3 y figura 1). Tire de Capillares de vidrio de hasta una punta fina con extractor de aguja (configuración: calentador = 15 unidades, solenoide = 4 A).Nota: Ver Tabla de materias para obtener más información del fabricante. Coloque la aguja capilar en un microinyector según instrucciones del fabricante y punta de la aguja de rotura por pellizcos con un par de pinzas para producir un punto agudo.Nota: Tamaños de abertura de aguja sugerido son ~ 150 μm para el mosquito y 250 μm para la mosca doméstica. Set microinyectora para volumen de dispensación deseado. Movimiento de menisco de ~ 50 alícuotas de nL es fácilmente observable y recomendado para microinyecciones de mosquito. Si está disponible, habilitar la configuración de inyección rápida. Enjuague la aguja de llenado y expulsión de agua libre de nucleasa 3 veces. Preparan soluciones para inyección en una concentración tal que 100\u2012150 nL proporcionará la dosis deseada para los mosquitos y 500 nL se proporcionan deseado dosis para moscas de la casa.Nota: Se sugiere dosis iniciales: 1 μg por cada mosquito y 5 μg de cada mosca5,9. Opcionalmente para los mosquitos, agrega rodamina B (para facilitar la visualización) soluciones a una concentración final de 3.0 μg/mL.Nota: El tinte será claramente visible por su color rosa después de la inyección a través de la cutícula casi transparente en la superficie ventral en la intersección de abdomen/tórax. Pipetear 3 – 4 μL de solución para inyectar en una superficie limpia (como un pedazo de la película de parafina) y sacar en la aguja de vidrio sin aspirar en aire. Oprima el botón de inyectar repetidamente hasta que el líquido comienza a dispensar de la aguja y limpie suavemente las gotas con un limpiador de tarea delicada.Nota: Mientras que algunos modelos de micromanipuladores requieren rellenar la jeringa, el inyector que se hace referencia en la Tabla de materiales no. Usando un marcador de punta ultra fina, dibuja marcas de hash ~ 1 mm aparte a partir del menisco de líquido a la caña de la aguja. Esto ayuda visualizar el movimiento del menisco y asegurar que la solución ha entrado en el mosquito durante la inyección. Establecer la diapositiva de mosquitos o moscas (ya preparada en los pasos 1.2 – 1.3) debajo de la aguja en la mesa chill o hielo (figura 1). Asegúrese de que campo de visión en el microscopio es suficientemente ancha como para ver el menisco de la solución en la aguja. Para los mosquitos, alinear la aguja con el tercio medio de la mesokatepisternum (figura 2A) y mientras apoya el mosquito contra la aguja con el fórceps en el lado opuesto, pinchar suavemente la cutícula con la punta de la aguja utilizando el Micrómetro de microinyector. Moscas de casa, alinear la aguja con el mesopleuron (figura 2B) y mientras que apoya la marcha contra la aguja, pinchar suavemente la cutícula con la punta de la aguja. Suavemente Deslice la aguja en el mosquito o mosca cuerpo hasta que la punta ha pasado a través de la línea media.Nota: Insertar la aguja demasiado poco a menudo resulta en el rebordear líquido inyectado por el insecto (ver paso 2.15). Mirando para el movimiento del menisco líquido en la aguja, oprima el botón inject hasta que se ha inyectado la cantidad deseada de líquido. Para los mosquitos, si a 50,6 alícuotas de nL, oprima 2 X ~ 100 nL o 3 X de ~ 150 nL. Para moscas de la casa, oprima el botón de inyectar hasta ~ 500 nL se ha inyectado (es decir, con alícuotas de nL 69 pulse 7 X para 483 nL). Si el menisco no se mueve, lentamente Deslice el mosquito o volar la aguja mirando para el movimiento del menisco. Si una parte de los granos de la solución inyectada de la cutícula al retiro de la aguja o si el menisco no se mueve, deseche el insecto como esta inyección no tuvo éxito. Transferir con éxito inyectados mosquitos en grupos de 10-15 o casa vuela en grupos de 5 para borrar 3,5 oz con tazas. Cubierta con tul o malla y recuperar a temperatura ambiente. Después de los mosquitos y las moscas se han recuperado (1 – 2 h), invertir cada taza de explotación sobre una bola de algodón empapada con solución de sacarosa al 10%.Nota: La inversión de la taza sobre el SIDA de algodón de sacarosa en la supervivencia de más fácil acceso a una comida de azúcar10. Enjuague la aguja como en el paso 2.5 entre soluciones de la inyección. Cuando termine de inyectar, descarte las agujas usadas en un contenedor apropiado. 3. bioensayo de mortalidad y la oviposición de aedes aegypti Tres días después de la inyección, continúan los mosquitos con 10% de sacarosa y anote el número de mosquitos visiblemente muertos. Llene una membrana artificial de 12 pulgadas (como tripa de salchicha de colágeno) con sangre fresca (es decir, bovino para Aedes aegypti) y el calor a 60 ° C en baño de agua caliente. Brevemente secar la membrana haciendo rodar sobre una toalla de papel y poner en las tapas de tul de 3.5 oz claro con tazas. Para mejorar la alimentación, spike sangre con 1 mM ATP después de haber calentado como un phagostimulant o por el asa la morcilla caliente con manos limpias dejar humanos volátiles en la superficie de la cubierta. Después de sangre alimentación, vuelva a colocar la bola de algodón empapada con sacarosa al 10% sobre las copas de celebración y mosquitos descansar ~ 24 h antes de transferir a tazas de oviposición. Tazas de oviposición de construcción llenando claro 3,5 oz tazas de bioensayo con ~ 30 mL desionizada H2O y colocando un trozo de papel de germinación de la semilla (~ 4 cm de ancho y 5 cm de largo con crestas corre verticalmente) en la parte inferior de la Copa y contra el costado (Figura 3A) . Cubierta con tul o malla y corte una abertura pequeña (~ 1 cm) en la tapa de tul o malla. En la alimentación de sangre después de 24 h, corte una hendidura pequeña (~ 1 cm) en la tapa de tul de la taza de explotación y sólo las hembras individuales que alimentado con éxito la transferencia, con un bolo de sangre visible en el abdomen, por la aspiración suave de boca en las tazas de oviposición (1 taza de mujer/oviposición). Sellar el corte pequeño en la tapa de la oviposición con una bolita de algodón saturada de sacarosa 10%. Sostener tazas ~ 27 ° c 5\u20127 días hasta que los mosquitos al oviposit completamente mientras que la mortalidad diaria de seguimiento. Contar huevos bajo un ámbito de disección. 4. bioensayo de mortalidad y la oviposición de Musca domestica Tres días después de la inyección, siguen las moscas con 10% de sacarosa y anote el número de moscas muertas visiblemente. Tres días después de la inyección, anestesiar a moscas, brevemente colocando un tubo de polietileno dosificación de CO2 sobre las copas de celebración hasta que todas las moscas son inmóviles en la parte inferior de las tazas. Transferencia vuela una jaula limpia, compuesto por un frasco de plástico de 4 L con una funda de punto que cubre la abertura (10 cm, figura 3B). Proporcionar moscas con agua y una mezcla de sacarosa granulada, leche en polvo y secó la yema de huevo en un 8: relación 8:1 (en volumen) durante cuatro días, grabar y quitar muerto vuela diariamente. Preparar los ingredientes secos por medio de cría larval mosca fresco mezclando 75% salvado de trigo con alimento por peso 25% peleteado para el ganado. Añadir agua hasta llegar a 62% de humedad (hasta que una gota de agua apenas puede ser exprimida hacia fuera). Preparar una bola de diámetro de 2.5 cm de una mezcla 1:1 de los anteriores medios larvas frescos y “utilizado” volar medio larval (medio en el que previamente han empupado moscas). Envolver la bola en un cuadrado de tela de algodón negro, apriete ligeramente hasta que el medio líquido se filtra a través y luego usar gomas para sujetar el paño en su lugar alrededor de la bola. Poner la bola en una copa de 60 mL y colocarlo en la jaula mosca de 5 horas (figura 3B). Enjuagar los huevos de la bola de oviposición y asegurar que los huevos se eliminan por debajo de los pliegues en la tela. Agite huevos para desarticular grupos y transferirlos a un tubo de centrífuga graduado de 20 mL con una pipeta de transferencia. Espere hasta que los huevos se colocan y tenga en cuenta el volumen de los huevos colocados en el tubo graduado. Añadir agua suficiente para llevar el volumen hasta 20 X el volumen de los huevos colocados. Registrar el volumen total de agua más huevos. Mientras se mezcla el agua y huevo suspensión con agitación vigorosa o una barra de agitación magnética, utilice una punta de la pipeta de 1 mL (con el extremo de la punta cortada) para dispensar 0.5 mL de la suspensión en un pedazo de paño negro previamente humedecido en una serie de líneas de agua y huevo. Contar los huevos con un microscopio de disección. Repita el paso 4.9 dos veces más. Si una de las cuentas es un outlier severa (es decir, se diferencia de las otras dos cuentas por > 35%), hacer un recuento de cuarta y caso omiso de los aislados. Calcular el número promedio de huevos por muestra y multiplicar este valor por 2 para obtener el número de huevos/mL de la suspensión. Multiplicar el valor de huevos/mL obtenido por el volumen de la suspensión del huevo del paso 4.8. Se trata de la estimación para el número total de huevos puestos.