再現可能な dsRNA のインジェクションと蚊とハエの産卵生物検定

1. 昆虫準備 いくつかの時間または 2 分露出を CO2 4 ° C でそれらを低温と、注射の前に 4 ° C で蚊を麻酔します。風邪は麻酔注射の前に h 4 ° C 2\u20123 で飛ぶ。蚊やハエが交尾産卵応答変数である場合を確認します。注: 蚊 anesthetization メソッドが種とひずみに依存などアカイエカヒトスジシマカネッタイシマカより冷たい anesthetization から早く回復、そのため CO2ノックダウンが望ましい。 氷の上慎重にステージ蚊やソフト鉗子を使用して腹レイアウトによってハエは顕微鏡スライド ~0.5 cm を公開しました。標準スライド 6 蚊の 2 つの行が保持できるまたは 6-7 家が飛ぶ。蚊やハエ スライド処理を支援するために明確なスライドの左または右の端に 1-1.5 cm を空けます。 注射の準備ができるまで大規模なペトリ皿の 4 ° C で段階的な昆虫のスライドを維持します。注: 上限を設定する排気に悩まされるから昆虫を防止できますシャーレの蓋に穴を掘削します。皿の底に固定されているガラス管のカップルにスライドを配置すると、シャーレから除去を緩和します。 2. 昆虫注入 Estep et al.による記述で dsRNA を準備します。5と Sanscrainteら9. 汚染物質の自由、dsRNA を吸光度 260 nm と260 × 希釈係数 × 40 μ g/mL で計算する RNA 濃度を測定する分光光度計を使用して示すことができるかどうか。 冷麻酔蚊とハエ (手順 1.1-1.3 と図 1を参照) の注射を実行するチル テーブルまたは浅いアイスペールを介して顕微鏡とマイクロインジェクター、その実力を解剖を設定します。 針の引き手と微細先端にガラス管を引く (設定: ヒーター = 15 ユニット、ソレノイド = 4 A)。注: 詳細については製造元の材料表を参照してください。 製造元の指示と休憩針先あたりマイクロインジェクターに一対の鋭いポイントを生成する鉗子でつまんでキャピラリー針を配置します。注: 推奨針開口部のサイズは、〜 150 μ m の蚊、イエバエの ~ 250 μ m です。 マイクロインジェクター目的の配信のボリュームを設定します。〜 50 nL 因数から半月の動きは容易にオブザーバブルと蚊のマイクロインジェクションにお勧めです。利用可能な場合は、高速インジェクションの設定を有効にします。充填し、ヌクレアーゼ フリー水を追放して 3 回針をすすいでください。 このような蚊の必要な投与量と 500 nL 100\u2012150 nL を提供することを提供する濃度で注入希望家のハエの線量のためのソリューションを準備します。注: 初期用量を提案した: 各蚊のため 1 μ g と各イエバエ5,9の 5 μ g。 必要に応じて蚊 (可視化支援) にローダミン B を 3.0 μ g/mL の最終的な集中にソリューションに追加できます。注: 染料腹部・胸部の交差点で腹側表面に透明に近いキューティクルを介して注入後そのピンクの色で明確に表示になります。 きれいな面 (パラフィン フィルムの一部) などに挿入し、任意の空気を吸うことがなくガラス針に描画ソリューションの 3-4 μ L をピペットします。液体を針から分配し、優しく繊細なタスク ワイパーで水滴を拭き取って開始まで繰り返し注入ボタンを押します。注: インジェクターの一部のモデルには、注射器のバックフィルが必要ですが、材料のテーブルで参照されているインジェクターはしません。 超微細ポイント マーカーを使用して、ハッシュ マーク 〜 1 mm 離れて始めて液体メニスカスから針のシャンクを描画します。半月の動きを可視化する支援、ソリューションが噴射中に蚊を入力したことを確認します。 チル テーブルまたは氷 (図 1) を針の下で蚊やハエ (1.2-1.3 の手順で準備) としてのスライドを設定します。確保する顕微鏡の視野の針でソリューション メニスカスを参照してくださいに十分に広いです。 蚊の針 mesokatepisternum (図 2 a) の中央 3 分の 1 を合わせ、穿刺針の先端を使用してキューティクルが優しく反対側に配置される鉗子針に対して蚊をブレース、マイクロインジェクター マイクロメータ。 家のハエの mesopleuron (図 2 b) 針を合わせ、針に対してフライを補強しながら穿刺針の先端とキューティクルが優しく。 優しく蚊の針の挿入または先端が正中線を通過するまでに体を飛ぶ。注: 多くの場合あまりにも浅い針を挿入する昆虫のうち注入された液体ビーズで結果 (2.15 の手順を参照してください)。 針で液体メニスカスの動き見ながら液体の適切な量を注入するまで注入ボタンを押します。蚊の場合 50.6 nL 因数に設定、〜 100 の 2 X を押して nL または 3 X 〜 150 nL。家のハエの ~ 500 nL が挿入されたまで注入ボタンを押す (すなわち、 69 の nL 因数に 483 の 7 X を押して nL)。 半月板が動かない場合ゆっくりと蚊をスライドまたはメニスカスの動きを見ながら針を飛ばします。この注射は、針除去またはメニスカスが移動する失敗したかどうかにキューティクルから注入する溶液のビーズの一部として昆虫を破棄する場合、うまくいきませんでした。 10-15 のグループに正常に挿入された蚊かハエ 3.5 oz カップを保持する 5 のグループに転送します。チュールや網でカバーし、室温で回復します。 蚊やハエが回復 (1-2 h) が後、10% ショ糖液を浸した綿球をそれぞれ保持カップを反転します。注: 砂糖の食事10に簡単にアクセスを提供することによって生存のショ糖綿エイズの上にカップの反転。 手順 2.5 注入ソリューション間のように針をすすいでください。注入し終わったら、破棄は適切なシャープス コンテナーの針を使用します。 3ネッタイシマカの死亡率と産卵の生物検定。 注射後 3 日間は、10% ショ糖を蚊を提供し、目に見えて死んだ蚊の数を記録し続けます。 新鮮な血 (すなわち、 ネッタイシマカの牛) と熱を湯浴で 60 ° C (コラーゲン ソーセージケーシング) など ≤12 インチの人工膜を入力します。 簡単にローリング ペーパー タオルの上で膜を乾燥し、向こうに透明なカップを保持している 3.5 オンスのチュール キャップ。栄養強化のため、ケーシング表面に人間の揮発性物質を残してきれいに素手で暖められた血のソーセージ、phagostimulant としてまたはハンドルを加熱後 1 mm ATP 血をスパイクします。 吸血後、~ 24 h の産卵カップに転送する前に残りの部分に蚊が持株のカップの上に 10% ショ糖溶液を浸した綿球を交換でき。 記入コンストラクト産卵カップ クリア 3.5 オンス バイオアッセイ カップ 〜 30 mL の脱イオン H2O と種子発芽の紙を置くこと (~ 4 cm と 5 cm 長い垂直に尾根) 側 (図 3 a) に対して、カップの下にあります。.チュールや網でカバーし、チュールやネット キャップで (~ 1 cm) の小さなスリットをカットします。 24 h 後の吸血で保持カップのチュール キャップ (~ 1 cm) の小さなスリットをカットし、供給正常に個々 の女性のみを転送-腹部で目に見える血の塊と-産卵カップ (1 女性/産卵カップ) に優しい口吸引によって。10% ショ糖飽和コットン ボールを持つ産卵キャップの小さなカットをシールします。 完全に死亡率を追跡しながらプレハブハウス蚊を許可する 5\u20127 日 〜 27 ° C でカップを保持します。解離の範囲の下に卵をカウントします。 4.イエバエにおける死亡率と産卵バイオアッセイ 注射後 3 日間は、引き続き 10% ショ糖をハエを提供し、目に見えて死んだハエの数を記録します。 投与後 3 日間は、簡単にすべてのハエとコップの底で動かず、ホールディング カップ以上の CO2を調剤ポリエチレン管を置くことによってハエを麻酔します。 オープニング (10 cm、図 3 b) をカバー メリヤス袖付き 4 L プラスチック瓶から成るきれいなケージにハエを転送します。ハエと水とグラニュー糖の混合物、粉ミルク、乾燥卵黄、8:8:1 の比率は (ボリューム) で 4 日間、死者の取り外しの記録と毎日就航します。 重量で 25% ペレット飼料の 75% 小麦ふすまの混入による新鮮なハエ幼虫飼育中の乾燥食材を準備します。(うち一滴の水を絞ることがやっとできる) まで水分 62% に到達する水を追加します。 上記の新規メディアの幼虫の 1:1 混合物から 2.5 cm 径のボールを準備し、幼虫の中を飛ぶ「使用」(中にハエが以前背地性)。ブラック コットン布の正方形でボールをラップ、中の液体は浸透するまで軽く絞るし、ボールの周りの場所に布を保持するためにゴムバンドを使用します。 60 mL カップにボールを入れて、5 h (図 3 b) のフライの檻の中に置きます。 リンスの卵を産卵ボールを切り、布のひだの下から卵が削除されていることを確認します。クラスターを混乱させると、ピペットと卒業 20 mL の遠心管に移して卵を振る。 卵は解決し、卒業管内定住卵のボリュームに注意してくださいされるまで待ちます。定住卵のボリューム X 20 までボリュームをもたらすに十分な水を追加します。水プラス卵の合計量を記録します。 電磁攪拌棒または激しく攪拌しながら水と卵の懸濁液を混合しながら (切断先端末) 1 mL ピペット先端部を使用して、一連のラインであらかじめ湿らせた黒い布の部分に水と卵懸濁液 0.5 mL を分注します。解剖顕微鏡の下で卵をカウントします。 手順 4.9 を 2 回繰り返します。カウントのいずれかの深刻な外れ値の場合 (すなわち、によって他の 2 つのカウントとは異なります > 35%)、4 カウント、外れ値を無視します。 サンプル当たりの卵数の平均を計算し、卵/mL の懸濁液の数 2 でこの値を乗算します。ステップ 4.8 から懸濁液卵の量によって得られる卵/mL 値を乗算します。これは卵の総数の見積もりです。