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Environment

Riproducibile dsRNA Microinjection e analisi biologica di deposizione delle uova di zanzare e mosche domestiche

Published: November 08, 2018
doi:
10.3791/58650
, , , ,
1USDA/ARS Center for Medical, Agricultural, and Veterinary Entomology, 2CMAVE Detachment,Navy Entomology Center of Excellence, 3Lovelace Respiratory Research Institute

Summary

Questo protocollo descrive una metodologia di microiniezione che abbiamo standardizzato e usati per diversi anni per fornire determinate quantità di acidi nucleici direttamente all’emolinfa di zanzare e mosche di casa. Questo protocollo risulta in una iniezione minima mortalità e consente di effettuare misure di dose correlato della fecondità.

Abstract

DsRNA sintetico, usato per indurre RNAi, può avere effetti fenotipici dipendente dalla dose. Questi effetti sono difficili da definire se il dsRNA vengono recapitate utilizzando un metodo non quantitativi. Consegna precisa di quantità note di acidi nucleici o altri prodotti chimici è fondamentale per misurare l’efficacia del composto in fase di test e per permettere il confronto affidabile tra composti.

Qui forniamo un protocollo riproducibile, quantitativa microiniezione che garantisce un’erogazione precisa delle dosi specifiche di dsRNA, riducendo la mortalità in genere indotta dalla ferita di iniezione. Queste modifiche includono l’aggiunta di Rodamina B, un ago per iniezione graduato, e un metodo di recupero migliore preso in prestito da Isoe e Collins. Questo metodo permette il calcolo delle risposte di dose e facilita il confronto tra composti. Versioni di questo metodo sono state usate con successo su tre generi di zanzare, come pure le mosche domestiche per valutare la riduzione della fecondità derivante dal silenziamento genico dei trascritti di RNA ribosomiale (rRNA).

Questo protocollo fornisce strategie per ridurre le diverse sfide di piccolo insetto microiniezione. Consegna insieme, meccanica di RNAds accompagnato da verifica visiva, identificazione di percorsi efficaci per la consegna e l’inclusione di un periodo di recupero post-iniezione garantire un dosaggio preciso e lesione bassa mortalità. Questo protocollo descrive anche un’analisi biologica di deposizione delle uova per determinazione uniforme degli effetti sulla fecondità.

Introduction

Fornire piccole biomolecole, quali gli acidi nucleici, ai Ditteri adulti ha dimostrato di essere impegnativo Culicidae sia Muscidae. Assorbimento orale di RNAds è stato segnalato per produrre sterilità (quando targeting esclusivamente geni espressi nei testicoli di adulti) e mortalità (quando la destinazione è SNF7 e un coattivatore del recettore steroide) in larvale Aedes aegypti1,2 . Mortalità è stato osservato anche quando la destinazione HSP70 in larvale Musca domestica3. Tali effetti fenotipici, tuttavia, non hanno portato dopo la poppata dsRNA per adulto Ae. aegypti in zucchero pasti4,5.

Microiniezione è stato utilizzato per eludere midgut quando l’introduzione di agenti patogeni o acidi nucleici, quindi inducendo una risposta sistemica5,6,7,8,9,10 . Esistono diverse tecniche di microiniezione, che coinvolgono attrezzature che vanno da in-House prodotti apparecchi che richiedono visual misurazione del volume di iniezione per iniettori controllato da microprocessore che consentono per la consegna automatica volume à partir 2.3 nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA interferenza (RNAi) trigger targeting ribosomal mRNAs, interrompono lo sviluppo ovarico in artropodi diversi come il segno di spunta di bestiame microplus Rhipicephalus, le zanzare Aedes aegypti e Culex pipiens, e la mosca domestica di Musca domestica5,9,12,13. In questi studi, la rottura della deposizione delle uova di monitoraggio è stato essenziale per determinare l’efficacia dell’inoculante del come il fenotipo può manifestarsi come cessazione o riduzione della progenie. Si tratta di una forma di multigenerational fenotipo letale che è un effetto critico e desiderato in molti dei metodi non tradizionali di biocontrollo come Wolbachia –infettati Introduzione maschi (incompatibilità sessuale) e RNAi indotta sterilità5 ,9,14. Rilevamento di fecondità e la mortalità è necessaria per la caratterizzazione e sviluppo di biorationals altamente specifico (agenti patogeni presenti in natura e/o derivati naturali)15.

Questo protocollo presenta dettagliate microiniezione per adulte zanzare e mosche domestiche; un processo che spesso non è ben descritto nella letteratura. Inoltre, le metodologie di analisi biologica di deposizione delle uova di valutare adeguatamente il dsRNA effetti sui Ditteri adulti sono descritti. Questi protocolli sono stati sviluppati specificamente per Aedes aegypti e Musca domestica ma possono essere modificati per altre specie.

Protocol

1. preparazione insetto Anestetizzare le zanzare da loro refrigerazione a 4 ° C per diverse ore o da esposizione a 2 min a CO2 e quindi si tiene a 4 ° C prima di iniezioni. Freddo anestetizzare mosche a 4 ° C 2\u20123 h prima di iniezioni. Garantire le zanzare e mosche sono accoppiati se la deposizione delle uova è una variabile di risposta.Nota: Il metodo amputate zanzara dipende dalla specie e ceppo, ad esempio, Culex , il recupero molto veloce da freddo amputate di Aedes aegypti e pertanto è preferibile atterramento di CO2 . Su ghiaccio, attentamente fase zanzare o mosche usando il forcipe morbido per adagiarle ventralmente esposti su microscopio vetrini ~0.5 cm di distanza. Diapositive standard possono contenere due file di 6 zanzare ogni o 6 – 7 casa mosche. Lasciare uno spazio di 1 – 1,5 cm all’estremità destra o sinistra della diapositiva chiara di zanzare o mosche per facilitare la gestione delle diapositive. Mantenere diapositive di insetti in fasi a 4 ° C in grandi piastre Petri fino a che pronto per l’iniezione.Nota: Un foro attraverso il coperchio della scatola di Petri aiuterà a prevenire insetti da essere disturbati da spostamento di aria quando tappatura. Posizionamento di diapositive su un paio di tubi capillari in vetro fissati al fondo piatto faciliterà la rimozione dalla piastra di Petri. 2. insetto iniezione Preparare il dsRNA come descritto da Estep et al. 5 e Sanscrainte et al. 9. se priva di contaminanti, dsRNA può essere quantificata utilizzando uno spettrofotometro per misurare l’assorbanza a 260 nm e calcolo concentrazione di RNA in μg/mL come un260 × diluizione fattore × 40. Impostare la dissezione microscopio e microinjector sopra un tavolo chill o superficiale secchiello del ghiaccio per eseguire iniezioni sul freddo-anestetizzati zanzare e mosche (vedi passo 1.1 – 1.3 e Figura 1). Tirare i tubi capillari in vetro a punta sottile con estrattore dell’ago (impostazioni: riscaldatore = 15 unità, solenoide = 4 A).Nota: Vedi Tabella materiali particolari del produttore. Inserire l’ago capillare in un microinjector come da istruzioni del produttore e punta dell’ago pausa pizzicando con un paio di pinze per la produzione di una punta acuminata.Nota: Ago suggeriti apertura dimensioni sono ~ 150 µm per zanzare e ~ 250 µm per Mosca. Impostare microinjector per volume di consegna desiderato. Movimento del menisco da aliquote nL ~ 50 è facilmente osservabile e consigliato per microiniezioni di zanzara. Se disponibile, attivare le impostazioni di iniezione veloce. Sciacquare l’ago di riempimento ed espellendo acqua priva di nucleasi 3 volte. Preparare soluzioni per iniezione ad una concentrazione tale che 100\u2012150 nL fornirà dose desiderata per le zanzare e 500 nL volontà fornire desiderati dose per mosche domestiche.Nota: Ha suggerito le dosi iniziali: 1 µ g per ogni zanzara e 5 µ g per ogni Mosca comune5,9. Per le zanzare, è facoltativamente possibile aggiungere Rodamina B (per facilitare la visualizzazione) per soluzioni ad una concentrazione finale di 3,0 µ g/mL.Nota: La tintura sarà chiaramente visibile dal suo colore rosa dopo l’iniezione attraverso la cuticola quasi chiara sulla superficie ventrale all’incrocio torace/addome. Pipettare 3 – 4 µ l di soluzione per iniettare su una superficie pulita (ad esempio un pezzo di pellicola di paraffina) e disegnare nell’ago di vetro senza succhiare in aria. Premere ripetutamente il pulsante di iniettare fino a quando il liquido comincia a dispensare dall’ago e pulire delicatamente le goccioline con un pulitore delicato compito.Nota: Mentre alcuni modelli di microinjectors richiedono reinterro la siringa, l’iniettore a cui fa riferimento la Tabella materiali non è così. Usando un pennarello punta ultra-fine, disegnare segni di hash ~ 1 mm apart a partire dal menisco liquido alla tibia dell’ago. Questo sarà di aiuto nel visualizzare il movimento del menisco e garantire che la soluzione abbia immesso la zanzara durante l’iniezione. Impostare la diapositiva di zanzare o mosche (come preparato in passi 1,2 – 1,3) sotto l’ago sul tavolo freddo o ghiaccio (Figura 1). Garantire tale campo visivo del microscopio è largo abbastanza per vedere il menisco di soluzione nell’ago. Per le zanzare, allineare l’ago con il terzo centrale di mesokatepisternum (Figura 2A) e mentre la zanzara contro l’ago di rinforzo con il forcipe collocato sul lato opposto, delicatamente perforare la cuticola con la punta dell’ago usando il micrometro di microinjector. Per casa mosche, allineare l’ago con la mesopleura (Figura 2B) e, mentre i rinforzi al volo contro l’ago, delicatamente perforare la cuticola con la punta dell’ago. Dolcemente scivolare l’ago la zanzara o volare il corpo fino a quando la punta è passato attraverso la linea mediana.Nota: Inserire l’ago troppo superficiale spesso provoca la bordatura liquida iniettata fuori l’insetto (Vedi punto 2.15). Mentre si guarda per il movimento del menisco liquido nell’ago, schiacciare il bottone di iniettare fino a quando la quantità desiderata di liquido è stata iniettata. Per le zanzare, se impostato su 50,6 aliquote di nL, premere 2 volte per ~ 100 nL o 3x per ~ 150 nL. Per casa mosche, schiacciare il bottone di iniettare fino a ~ 500 nL è stato iniettato (cioè, con 69 aliquote nL premere 7 X per 483 nL). Se il menisco non si muove, lentamente scivolare la zanzara o volare via l’ago mentre si guarda per il movimento del menisco. Se una parte dei branelli soluzione iniettata dalla cuticola alla rimozione dell’ago o se il menisco non riesce a muoversi, scartare l’insetto come questa iniezione non è riuscita. Trasferire con successo iniettate zanzare in gruppi di 10-15 o mosche domestiche in gruppi di 5 per cancellare 3,5 oz holding tazze. Coprire con tulle o reticolato e recuperare a temperatura ambiente. Dopo le zanzare e le mosche hanno recuperato (1 – 2 h), è possibile invertire ogni tazza che tiene sopra un batuffolo di cotone imbevuto con soluzione di saccarosio al 10%.Nota: L’inversione della Coppa in cima l’aids di cotone di saccarosio nella sopravvivenza di facilitare l’accesso a un pasto di zucchero10. Sciacquare l’ago come descritto al punto 2.5 tra soluzioni di iniezione. Quando fatto l’iniezione, gettare usati aghi in appositi contenitori. 3. analisi biologica di mortalità e deposizione delle uova di aedes aegypti Per tre giorni dopo l’iniezione, continuare a fornire le zanzare con 10% di saccarosio e registrare il numero di zanzare visibilmente morti. Riempire una membrana artificiale ≤ 12 pollici (come involucro di salsiccia di collagene) con sangue fresco (cioè, bovino per Aedes aegypti) e calore a 60 ° C nel bagno d’acqua calda. Brevemente a secco la membrana facendo rotolare su un tovagliolo di carta e laici attraverso i tappi di tulle del 3,5 oz chiaro holding tazze. Per migliorare l’alimentazione, spike sangue con 1 mM ATP dopo riscaldamento come un phagostimulant o dalla maniglia la salsiccia di sangue riscaldato con le mani pulite di lasciare sostanze volatili umani sulla superficie del corpo. Dopo sangue alimentazione, sostituire il batuffolo di cotone imbevuto con 10% di saccarosio in cima le tazze della holding e consentire le zanzare a riposare per ~ 24 h prima del trasferimento a tazze di deposizione delle uova. Tazze di deposizione delle uova di costrutto compilando clear 3,5 tazze di analisi biologica di oz con ~ 30 mL deionizzata H2O e mettendo un pezzo di carta di germinazione del seme (~ 4 cm di larghezza e 5 cm di lunghezza con creste verticalemente) nella parte inferiore della Coppa e contro il lato (Figura 3A) . Coprire con tulle o reticolato e tagliare una piccola fessura (~ 1 cm) nel tappo tulle o reticolato. 24 h del post-sangue pasto, tagliare una piccola fessura (~ 1 cm) del tappo di tulle di piattello e trasferire solo le femmine individuali che correttamente alimentati — con un bolo di sangue visibile nell’addome — dall’aspirazione di bocca delicata nelle tazze di deposizione delle uova (1 tazza donna/deposizione delle uova). Sigillare il piccolo taglio all’occhiello di deposizione delle uova con un batuffolo di cotone saturato di saccarosio di 10%. Tenere tazze a ~ 27 ° C per 5\u20127 giorni per consentire le zanzare per oviposit completamente tenendo traccia di mortalità giornaliera. Contare le uova in un ambito di dissezione. 4. analisi biologica di deposizione delle uova e la mortalità di Musca domestica Per tre giorni dopo l’iniezione, continuare a fornire le mosche con 10% di saccarosio e registrare il numero di mosche morte visibilmente. Tre giorni dopo l’iniezione, anestetizzare mosche inserendo brevemente un tubo di polietilene erogazione CO2 le tazze che tiene fino a quando tutte le mosche sono immobile al fondo delle coppette. Trasferimento mosche in una gabbia pulita composta da un barattolo di plastica 4 L con una manica di maglia rasata che copre l’apertura (10 cm, Figura 3B). Fornire mosche con acqua e una miscela di saccarosio granulato, latte in polvere e asciugato il tuorlo d’uovo in un 8: rapporto di 8:1 (in volume) per quattro giorni, registrazione e rimozione morta vola tutti i giorni. Preparare gli ingredienti secchi per mezzo di allevamento larvale Vola fresco con 75% di crusca di frumento con alimentazione in peso del 25% pellettati bestiame. Aggiungere acqua per raggiungere 62% umidità (fino a quando una goccia d’acqua può a malapena essere spremuta fuori). Preparare una sfera del diametro di 2,5 cm da una miscela di 1:1 dei media larvale freschi sopra e “utilizzato” Vola larvale medio (medium in cui mosche sono popolate in precedenza). Avvolgere la palla in un quadrato di stoffa di cotone nero, premere leggermente fino a medio liquido filtra attraverso, quindi utilizzare elastici per tenere il panno sul posto intorno alla palla. Mettere la palla in una tazza di 60 mL e metterlo nella gabbia Vola per 5 h (Figura 3B). Sciacquare le uova fuori la palla di deposizione delle uova e che le uova vengano rimossi da sotto pieghe nel tessuto. Agitare le uova per disgregare i cluster e trasferirli in una provetta da centrifuga da 20 mL graduata con una pipetta di trasferimento. Attendere fino a quando le uova si noti il volume delle uova depositate nel tubo graduato e trasferirsi. Aggiungere acqua sufficiente per portare il volume fino a 20 volte il volume delle uova depositate. Registrare il volume totale di acqua più uova. Durante la miscelazione la sospensione acqua e uovo con ancoretta magnetica o agitazione vigorosa, usare una punta di dispensare 1 mL (con l’estremità della punta tagliata) per erogare 0,5 mL della sospensione acqua e uovo su un pezzo di panno nero pre-umidificata in una serie di linee. Contare le uova sotto un microscopio per dissezione. Ripetere il passaggio 4.9 altre due volte. Se uno dei conteggi è un outlier grave (cioè, si differenzia da altri due conti di > 35%), fare un conteggio quarto e ignorare il valore erratico. Calcolare il numero medio di uova per campione e moltiplicare questo valore per 2 per ottenere il numero di uova/mL della sospensione. Moltiplicare il valore di uova/mL ottenuto dal volume della sospensione uovo dal punto 4.8. Questa è la stima per il numero totale di uova deposte.

Representative Results

Microiniezione di dsRNA nelle zanzare Questo metodo di microiniezione è stato utilizzato nel nostro laboratorio per valutare l’espressione genica, mortalità e la risposta di deposizione delle uova per oltre 80 dsRNA trigger in parecchi generi di zanzara (Aedes, Anopheles, Culex). L’iniezione di femmine dal ceppo di Colonia di Ae. aegypti (ORL1952) con 1 µ g di dsRNA derivato dalle trascrizioni ribosomale RPS6 e RPL26 (Vedi Estep et al. 5 per sequenza dati e metodi di produzione di dsRNA) hanno mostrato significativa riduzione nella espressione relativa (RE) attraverso deposizione delle uova più cicli rispetto alle zanzare iniettate con un dsGFP di controllo. Aedes aegypti RE misurata seguendo il ciclo di gonotrophic 2nd ha mostrato una riduzione significativa dell’espressione RPS6 (P < 0,05) nelle zanzare iniettate con dsRPS6 come determinato da un test di Student t-tra il controllo di dsGFP dello stesso gruppo (Figura 4),5 . Fecondità è stata valutata dalle femmine individuali utilizzando l’analisi biologica di deposizione delle uova descritto qui. Dopo post-l’iniezione 3 giorni, le zanzare erano sangue alimentato, trasferito in contenitori individuali di deposizione delle uova e permesso di posare fino al completamento. Dimensioni medio frizione per il primo ciclo di gonotrophic sono stati ridotti significativamente per entrambi dsRPS6 trattati Ae. aegypti (n = 102 femmine, 1,3 ± 0,8 (media ± SE) uova) e dsRPL26 trattati (n = 86 femmine, 4,0 ± 1.1 uova) quando rispetto alle iniezioni di dsGFP (n = 79 femmine, 49,3 ± 3.5 uova, Figura 5A). Valutazione frizione dopo un secondo ciclo di gonotrophic ha mostrato anche significativamente ridotta deposizione delle uova per entrambi i gruppi trattato di dsRNA, ma con effetto ridotta dimensione. Dimensioni del gruppo di Ae. aegypti erano variabili e così significa separazione è stata realizzata da Dunn prova5. Venti-quattro-ora la mortalità era normalmente 3% o meno. Un effetto di dose precisa è stato osservato durante l’iniezione del dsRPS6 da 1 µ g a 50 ng in femmina Ae. aegyptie la nidiata variano in modo significativo rispetto ai controlli di 1 µ g/donna dsGFP iniettato in tutti, ma la dose di dsRPS6 di 25 ng/femmina (figura 5B). Microiniezione di dsRNA in casa mosche Colonia Musca domestica (ORL normale) sono stati iniettati con 5 µ g di dsRNA costrutti progettato contro la Mosca della casa RPS6 e RPL26 trascrizioni9. Come è stato osservato in Ae. aegypti, significativa riduzione dell’espressione di trascrizione specifico sia (RPS6 e RPL26) e riduzione delle dimensioni della frizione è stati osservati (Figura 4 e Figura 5A). Riduzione significativa in RE è stata determinata mediante test t di Student tra il controllo di dsGFP dello stesso gruppo (P < 0,05) e il test di Holm-Sidak era utilizzato per determinare il significato tra le dimensioni di frizione per diversi M. domestica gruppi di trattamento. Dissezioni ovariche ha mostrato ridotta oogenesi nei trattamenti dsRPS6 e dsRPL26, mentre dsGFP alimentati mosche avuto vitellogenina normale deposizione come voto il Tyndale Biscoe scala9. Figura 1: installazione di microiniezione per la consegna microvolumi per adulte zanzare e mosche casa. Le iniezioni vengono eseguite sugli insetti freddo-anestetizzati in scena su vetrini da microscopio sopra un tavolo chill. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Siti di microiniezione per Ae. aegypti e M. domestica. (A) adulto Ae. aegypti vengono iniettati nel terzo centrale della mesokatepisternum. (B) adulto M. domestica sono iniettati nella mesopleura. Le frecce indicano i siti di iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: installazione di analisi biologica di deposizione delle uova. (A) Ae. aegypti dosaggio di deposizione delle uova delle tazze con carta di germinazione del seme come substrato di deposizione delle uova, ricoperto con tulle e 10% cotone imbevuto di saccarosio. (B) adulto femmina M. domestica in un contenitore di dosaggio di deposizione delle uova con il cibo (A), acqua (B) e dei media larvale (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Espressione relativa di RPS6 in Ae. aegypti e M. domestica iniettati con il dsRNA specie-specifici. Aedes aegypti e M. domestica sono stati iniettati con µ g 1 e 5, rispettivamente di entrambi dsRNA di controllo (dsGFP) o dsRNA progettato contro RPS6 o RPL26 trascrizioni da ogni insetto. Riduzione significativa (P < 0,05) di RPS6 espressione è stata osservata in zanzare e mosche iniettati con dsRPS6 e dalle mosche iniettati con dsRPL26 (indicato da un asterisco). Barre di errore rappresentano la media ± SE e numero in base a colonna indica il numero di individui esaminati. Questa figura è stata modificata da Estep et al. 5 e Sanscrainte et al. 9. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Frizione media dimensione di Ae. aegypti e M. domestica iniettati con il dsRNA specie-specifici. (A) deposizione dell’uovo è stata ridotta significativamente (P < 0,05) sia Ae. aegypti e M. domestica dopo l’iniezione di 1 e 5 µ g rispettivamente di uno dei due controlli dsRNA (dsGFP) o dsRNA progettato contro RPS6 o RPL26 trascrizioni da ogni insetto. Gli asterischi indicano differenze significative dal controllo dsGFP dello stesso gruppo. Barre di errore rappresentano la media ± SE e numero in base a colonna indica il numero di individui esaminati. Questa figura è stata modificata da Estep et al. 5 e Sanscrainte et al. 9. (B) curva Dose di Ae. aegypti iniettato con dsRPS6 da 50 ng/femmina a 1000 ng/donna mostra le riduzioni significative in fecondità rispetto alle coorti dsGFP iniettato (50, 100 e 1000 ng/donna). Barre di errore rappresentano la media ± 95% CI da 36-81 organismi individuali per ogni somministrazione. Punti con lettere rappresentano una differenza significativa tra i gruppi (P < 0,05) identificato mediante ANOVA. Questa figura è stata modificata da Estep et al. 5. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Microiniezione è una tecnica di prezioso laboratorio per garantire la consegna di dsRNA o altri biorationals (cioè, pesticidi, virus, microsporidia). Mentre molti laboratori eseguono microiniezione, l’esatta quantità iniettata è spesso poco chiara a causa di limitazioni tecniche del sistema di consegna dove il volume erogato non è direttamente misurata11. Concentrazione e volume erogato sono parametri critici che consentano di calcolare misure standard tossicologiche ad esempio CE50 o IC50 o per definire minimo efficaci dosi5,16. Ciò è particolarmente importante negli studi funzionali mediante RNAi in insetti adulti, dove consegna di alimentazione non comporta sempre l’esposizione sistemica a particelle volute e la dose effettiva attraversamento midgut è poco chiaro5.

Mentre la procedura di microiniezione può essere inizialmente difficile, rapidi miglioramenti nella precisione di velocità e consegna sono raggiunti con pratica e pazienza. Padroneggiare la stessa procedura di iniezione è un investimento di tempo, ma, una volta compiuta, la procedura produce risultati ripetibili e mortalità ferita di < 3%. Il rapporto di successo iniezioni aumenterà come competenza aumenta iniezione consentendo di 300 zanzare o mosche al giorno.

Molte delle sfide di microiniezione sono dovuto l’ago utilizzato. Determinazione del punto di interruzione corretta dell’ago capillare e angolo di punta è un aspetto difficile della procedura e richiede alcuni tentativi ed errori per determinare la dimensione di apertura più efficace per una determinata specie. Il fine dell’ago più utili per il microinjection di zanzara (~ 150 µm) è troppo piccolo per fornire rapidamente il più grande volume iniettato in mosche mentre al contrario, la più grande apertura dell’ago che funziona su mosche (~ 250 µm) provoca danni di vasta ferita per le zanzare più piccole e la mortalità di iniezione inaccettabile. Un ago rotto con una punta smussata è spesso difficile da ottenere attraverso la cuticola senza danni ai tessuti e aumento della mortalità. Scale dell’insetto o pezzi di tessuto possono ostruire aghi nel corso di un esperimento, quindi spesso è utile avere diversi aghi tirati se sia necessaria la sostituzione. Abbiamo trovato che è più facile sostituire un ago difficile piuttosto che spendere tempo per cercare di cancellare un ago inceppato o sporche.

Osservando la soluzione di iniezione entrando l’insetto è fondamentale affinché le iniezioni non riuscite possono essere rimosso (vedere i passaggi 2.14-2.15). Rodamina B aggiunta alla soluzioni di iniezione fornisce una visuale chiara per garantire che in scena fredda insetti ricevere dosaggio corretto e risulta particolarmente utili durante la pratica (Vedi punto 2.7).

I metodi di analisi biologica di iniezione e deposizione delle uova qui presentati con successo hanno indotto gene atterramento e misurabili effetti fenotipici in adulto Ae. aegypti e M. domestica quando usando RNAds progettato contro specie-ribosomiale trascrizioni (Figura 4 e Figura 5A). Inoltre, la capacità di questo metodo di fornire con precisione microvolumi agli individui consente curve di risposta dose deve essere generato per piccole quantità di materiale (à partir de 50 ng; Figura 5B). Ciò è particolarmente utile per i metodi come screening siRNA o dsRNA, come la produzione di grandi quantità di queste molecole possa essere costi proibitivi.

Questo metodo può essere modificato per iniettare agenti biologici (virus, batteri, microsporidia) o pesticidi chimici, dopo essersi assicurato che qualsiasi buffer di consegna sono innocui per iniezione. Come volume di consegna è limitata dalle dimensioni dell’insetto, producendo concentrata soluzioni di prova sono di importanza.

Per valutare adeguatamente l’efficacia dsRNA, è necessario tenere traccia di deposizione delle uova come fenotipi letali possono manifestarsi solo nella progenie. Come presentato qui, tenendo la femmina Ae. aegypti separatamente dopo blooding permette per determinare la dimensione individuale della frizione e ulteriori test sugli stessi individui può essere fatto a valle di deposizione delle uova (cioè, studi di espressione genica, Ulteriori gonotrophic cicli, atterramento specifico tessuto) per correlare la capacità riproduttiva con altre misure, come l’espressione genica. Come M. domestica oviposit generalmente in una risposta di gruppo, incitare isolati mosche gravid porre è molto manodopera intensiva e non pratico per grandi numeri di individui17. Di conseguenza, viene presentato un metodo per determinare la dimensione media della frizione.

Il metodo di microiniezione presentato qui fornisce la consegna coerenza sistemica a casa mosche e zanzare. Accoppiato con la mortalità e la deposizione delle uova rilevamento delle analisi biologiche, questi strumenti versatili possono essere utilizzati per valutare gli effetti fenotipici e post-trascrizionali di piccole molecole di RNA, agenti biologici e pesticidi tradizionali dove la consegna orale non è praticabile.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li e Roxie White (USDA-ARS) per aiutare con acquisizione dati e analisi. Ringraziamo anche d. ssa Pia Olafson (USDA-ARS) e Ke Wu (University of Florida) per revisione critica del manoscritto e Niklaus Hostettler (University of Florida) per le riprese il metraggio di microscopio. Finanziamento è stato fornito dall’USDA, il progetto WII – 141C della Navy e Marine Corps Public Health Center e il programma di protezione distribuito combattenti di guerra. I finanziatori non avevano alcun ruolo nella progettazione o nella direzione dello studio o sviluppo del manoscritto.

Materials

needle pulling
vertical pipette puller Kopf 720 settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm World Precision Instruments 504949 capillaries for pulling glass needles
Name Company Catalog Number Comments
microinjector station
Nanoliter 2010 World Precision Instruments NANOLITER2010 microinjector
manual micromanipulator World Precision Instruments KITE-L left hand KITE manipulator
magnetic stand World Precision Instruments M9 holds micromanipulator
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand World Precision Instruments PZMIII-BS dissecting scope for microinjections
1.5X objective World Precision Instruments 501377 objective for microscope
light LED ring World Precision Instruments 504134 light ring for injection microscope
laboratory chill table BioQuip Products 1431 chill table for microinjections
microscope slides Fisher Scientific 12-544-1 for staging insects while injections
Rhodamine B, 98+% Acros Organics AC296571000
Name Company Catalog Number Comments
mosquito oviposition bioassays
large Petri dish Fisher Scientific FB0875714 for holding staging slides
plastic cup – 3 1/2 oz. Dart Container Corporation TK35 mosquito oviposition bioassay cups
matte tulle fabric Joanne Fabrics 1103068 caps for oviposition bioassays
blood source locally acquired typically bovine or live chickens
1 x 30mm clear edible collagen casing Butcher and Packer 30D02-05
heavy weight seed germination paper Anchor Paper Co SD7615L
oral aspirator with HEPA filter John W. Hock Company 612
Name Company Catalog Number Comments
house fly oviposition bioassays
4 L plastic food storage canister Walmart 555115143
10-inch stockinette sleeve Medonthego.com FS15001H
wheat bran locally acquired typically found at feed stores
Calf Manna performance supplement ValleyVetSupply.com 16731 pelleted livestock feed
dried egg yolk BulkFoods.com 40506
black cotton cloth locally acquired typically in craft supplies section
60 mL cup Dart Container Corporation P200-N
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References

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Sanscrainte, N. D., Waits, C. M., Geden, C. J., Estep, A. S., Becnel, J. J. Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies. J. Vis. Exp. (141), e58650, doi:10.3791/58650 (2018).
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