DsRNA לשחזור Microinjection, ההטלה Bioassay של יתושים וזבובים הבית

1. הכנה חרקים עזים ומתנגד יתושים על ידי מצמרר אותם על 4 מעלות צלזיוס למשך מספר שעות, או על ידי חשיפה 2 דקות CO2 ולאחר מכן החזקת ב 4 ° C לפני זריקות. קר עזים ומתנגד זבובים-2\u20123 4 ° C h לפני זריקות. להבטיח יתושים וזבובים והידנית אם ההטלה הוא משתנה התגובה.הערה: שיטת ההרדמה יתושים תלוי המין ואת המתח, למשל, כולכית להתאושש מהר מן ההרדמה קר יותר Aedes aegypti , ולכן עדיפה CO2 נוקאאוט. על קרח, בזהירות שלב יתושים או זבובים באמצעות מלקחיים רך כדי לפרוס אותם ventrally חשופות על שקופיות מיקרוסקופ ~0.5 ס”מ אחד מהשני. שקופיות רגיל יכול להכיל שתי שורות של 6 יתושים או זבובים בית 6-7. השאירו רווח 1 – 1.5 ס”מ בקצה השמאלי או הימני של השקופית ברורה של יתושים או זבובים כדי לסייע שקופית טיפול. לשמור על שקופיות של חרקים בשלבים 4 ° C בפטרי גדולה עד מוכן להזרקה.הערה: קידוח חור המכסה פטרי תסייע למנוע חרקים להיות מוטרדת עקירה אוויר כאשר מיצוי. הצבת שקופיות על זוג נימים זכוכית מאובטח לתחתית צלחת תקל להסרת מ פטרי. 2. חרקים הזרקה להכין dsRNA כפי שתואר על ידי אסטפ. et al. 5 ו. Sanscrainte et al. 9. אם חינם של מזהמים, dsRNA ניתן לכמת באמצעות ספקטרופוטומטרים כדי למדוד את ספיגת 260 ננומטר, חישוב ריכוז ה-RNA μg/mL כמו260 × דילול גורם × 40. להגדיר לנתח מיקרוסקופ, microinjector מעל הטבלה צונן או דלי קרח רדוד לבצע זריקות ומורדמת קר יתושים, זבובים (ראה צעד 1.1-1.3 ו איור 1). . עצור נימים זכוכית טיפ בסדר עם מחט פולר (הגדרות: דוד = 15 יחידות, ברז חשמלי = 4 א).הערה: ראה טבלה של חומרים לפרטים של היצרן. למקם את המחט נימי microinjector לפי הוראות היצרן, הפסקה מחט מאת צובט עם זוג מלקחיים כדי לייצר בחוד.הערה: מחט המוצע הפתיחה גדלים הם מיקרומטר ~ 150 עבור יתושים ~ 250 מיקרומטר של זבוב הבית. הגדר microinjector עבור נפח המשלוח הרצויה. מניסקוס תנועה מ ~ 50 nL aliquots היא בקלות הנצפה ומומלצת יתוש microinjections. אם הוא זמין, אפשר הגדרות זריקה מהירה. יש לשטוף את המחט על ידי מילוי וגירשו את המים ללא נוקלאז 3 פעמים. להכין פתרונות עבור הזרקה-ריכוז כזה כי 100\u2012150 nL יספק המינון הרצוי עבור יתושים ורצון nL 500 לספק הרצוי במינון לזבובים הבית.הערה: הציע מינונים הראשונית: µg 1 עבור כל יתוש ו µg 5 עבור כל זבוב5,9. באופן אופציונלי עבור יתושים, להוסיף Rhodamine B (כדי לסייע ויזואליזציה) פתרונות-ריכוז סופי של 3.0 µg/mL.הערה: לצבוע יהיה גלוי בבירור על ידי צבעו ורוד לאחר הזרקה דרך הקוטיקולה כמעט ברור על פני השטח הגחון בצומת בית החזה/בטן. Pipette µL 3-4 פתרון להזריק על משטח נקי (כגון פיסת סרט צילום פרפין) ויש למשוך המחט זכוכית ללא מכניסה אוויר. נלחצים לחצן הכנס שוב ושוב עד שהנוזל מתחיל לוותר על מן המחט לנגב בעדינות טיפות עם מגב המשימה העדינה.הערה: בעוד כמה דגמים של microinjectors דורשים למלא את משבצות המזרק, מזרק שאוזכרו טבלה של חומרים לא נכון. באמצעות סמן הצבע בסדר אולטרה, צייר hash סימני ~ 1 מ”מ בנפרד החל מניסקוס נוזלי הדוקרן המחט. זה לסייע להמחיש את התנועה מניסקוס ולהבטיח כי הפתרון נכנסה היתוש במהלך ההזרקה. הגדר את השקופית של יתושים או זבובים (כפי שהוכנו בשלבים 1.2-1.3) תחת המחט תירגע הטבלה או קרח (איור 1). להבטיח את שדה ראייה במיקרוסקופ הוא מספיק רחב לראות את הפתרון מניסקוס במחט. היתושים, ליישר את המחט עם האמצעי-שליש mesokatepisternum (איור 2 א), בעוד וחיבקה היתוש נגד המחט עם מלקחיים מניחים בצד הנגדי, בעדינות לנקב את הקוטיקולה באמצעות קצה המחט microinjector מיקרומטר. לזבובים הבית, ליישר את המחט עם mesopleuron (איור 2B) ו, תוך מרענן הזבוב נגד המחט, בעדינות לנקב את הקוטיקולה עם קצה המחט. בעדינות להחליק את המחט לתוך היתוש או לעוף הגוף עד הקצה עבר דרך האמצע.הערה: החדרת המחט רדוד מדי לעתים קרובות התוצאה פלאיירים נוזלי מוזרק החרק (ראה שלב 2.15). תוך כדי צפייה על התנועה של מניסקוס נוזלי במחט, נלחצים לחצן הכנס עד שהוחדרו את הכמות הרצויה של נוזל. היתושים, אם להגדיר 50.6 nL aliquots, הקש 2 X עבור ~ 100 nL או 3 X ~ 150 nL. לזבובים הבית, נלחצים לחצן הכנס עד ~ 500 nL שהוחדרו (קרי, עם 69 nL aliquots מסחטת 7 X 483 nL). אם אלך להביא את האלונקה לא זזה, לאט שקופית היתוש או לטוס המחט תוך כדי צפייה לתנועה מניסקוס. אם חלק של חרוזים פתרון מוזרק החוצה הקוטיקולה על הסרת מחט או אם אלך להביא את האלונקה נכשל להעביר, למחוק את החרק כמו הזרקה זו היה לא מוצלח. להעביר בהצלחה מוזרק יתושים בקבוצות של 10-15 או הבית זבובים בקבוצות של 5 כדי לנקות את עוז 3.5 מחזיק כוסות. לכסות עם טול או אחר תנועותיהם ולשחזר בטמפרטורת החדר. לאחר יתושים וזבובים התאוששו (1 – 2 h), היפוך כל גביע אחזקות על כדור צמר גפן טבול עם 10% סוכרוז הפתרון.הערה: ההיפוך של הגביע על גבי כל העזרים כותנה סוכרוז הישרדות על-ידי מתן גישה קלה יותר על ארוחה של סוכר10. לשטוף את המחט כמו שלב 2.5 בין הזרקת פתרונות. בסיום הזרקת, המשומשות מחטים במיכל שרפ המתאים. 3. aedes aegypti bioassay התמותה, ההטלה במשך שלושה ימים לאחר ההזרקה, ממשיכים לספק יתושים עם 10% סוכרוז ולהקליט את המספר של יתושים מתים בעליל. למלא ≤12 אינץ קרום מלאכותי (כגון קולגן נקניק) עם דם טרי (קרי, שור עבור Aedes aegypti) ומחממים עד 60 ° צלזיוס באמבט מים חמים. בקצרה יבש הקרום על ידי גלגול על מגבת נייר ושכבה על פני הפקקים טול של עוץ 3.5 ברור מחזיק כוסות. כדי לשפר האכלה, ספייק דם עם 1 מ מ ATP לאחר חימום כמו phagostimulant או על-ידי אחיזה של נקניק דם ומחוממת נקי החשופות לעזוב שיכללו חומרים נדיפים אנושי על פני מעטפת. לאחר דם האכלה, להחליף את כדור צמר גפן ספוג עם 10% סוכרוז על גבי מחזיק כוסות ולאפשר יתושים לנוח ~ 24 h לפני העברת כוסות ההטלה. לבנות כוסות ההטלה באמצעות מילוי נקה 3.5 כוסות bioassay עוז עם ~ 30 מ”ל יונים H2O והנחת פיסת נייר נביטת זרעים (~ 4 ס”מ ו- 5 ס מ ארוך עם הרכסים העוברים במאונך) בחלק התחתון של הגביע, כנגד הצד (איור 3 א) . מכסה עם טול או אחר תנועותיהם, לחתוך חתך קטן (~ 1 ס מ) בהכיפה טול או אחר תנועותיהם. ב 24 שעות דם שלאחר האכלה, לחתוך חתך קטן (~ 1 ס מ) בהכיפה טול של גביע אחזקות ולהעביר רק נקבות בודדות אשר בהצלחה האכילה – עם מנת דם גלוי בבטן — על ידי השאיפה הפה עדין לכוסות ההטלה (1 כוס נקבה/הטלה). חותם את החתך קטן על הכיפה הטלה עם כדור צמר גפן רוויות 10% סוכרוז. מחזיק כוסות ב ~ 27 ° C 5\u20127 ימים לאפשר יתושים oviposit באופן מלא תוך מעקב יומי התמותה. ספור ביצים תחת טווח ויבתר. 4. זבוב דומסטיקה bioassay התמותה, ההטלה במשך שלושה ימים לאחר ההזרקה, להמשיך לספק את הזבובים עם 10% סוכרוז ולהקליט את המספר של זבובים מתים בעליל. שלושה ימים לאחר ההזרקה, עזים ומתנגד זבובים על ידי בקצרה הנחת צינור פוליאתילן dispensing CO2 מעל מחזיק כוסות עד מכל הזבובים ללא תנועה בחלק התחתון של הכוסות. העברת הזבובים כלוב נקי מורכבת צנצנת פלסטיק 4 L עם שרוול stockinette מכסה הפתח (10 ס”מ, איור 3B). לספק מים זבובים עם תערובת של סוכרוז מגורען, אבקת חלב, ייבשה חלמון ביצה ב 8:8:1 יחס (לפי נפח) במשך ארבעה ימים, הקלטה של הסרת מת טיסות יומיות. היכונו החומרים היבשים טריים לטוס זחל גידול בינוני על ידי ערבוב 75% סובין חיטה עם משק 25% מגורען לפי משקל. מוסיפים מים כדי להגיע 62% לחות (עד טיפת מים יכול להתמצות בקושי החוצה). להכין כדור בקוטר 2.5 ס מ מתערובת 1:1 של התקשורת זחל טריים לעיל, “שימוש” לטוס בינוני זחל (בינוני שבו יש זבובים בעבר pupated). עוטפים את הכדור בכיכר של בד כותנה שחור, לסחוט בעדינות עד בינוני נוזלי מבצבץ דרך ולאחר מכן השתמש גומיות כדי להחזיק את הבד במקום סביב הכדור. לשים את הכדור בתוך כוס 60 מ ל ולמקם אותו בכלוב לטוס במשך 5 שעות (איור 3B). לשטוף ביצים מהכדור ההטלה ולהבטיח כי הביצים יוסרו מתחת קפלי הבד. לנער ביצים כדי לשבש את אשכולות ומעבירים אותם אל שפופרת צנטרפוגה mL 20 בוגר עם pipet העברה. המתן עד הביצים ליישב ורשום את עוצמת הקול של הביצים התיישבו הצינור. להוסיף מים כדי להביא אמצעי האחסון עד 20 X הנפח של ביצים התיישבו. להקליט את הנפח הכולל של מים בתוספת ביצים. תוך כדי ערבוב את המתלים מים וביצה עם בר מערבבים מגנטי או ערבוב נמרץ, להשתמש טיפ pipet 1 מ”ל (עם סוף קצה מנותקים) כדי לשלול 0.5 מ של מים וביצה התליה על חתיכת בד שחור מראש בטעימת בסדרה של קווים. לספור את הביצים במיקרוסקופ ויבתר. חזור על שלב 4.9 עוד פעמיים. אם אחד מהסעיפים חריג חשוד טעות חמורה (קרי, נבדל שני סעיפים אחרים על-ידי > 35%), לבצע ספירה רביעית והתעלם את חריג חשוד טעות. לחשב את מספר הביצים לדגימה רשע ולהתרבות ערך זה על ידי 2 כדי לקבל את מספר הביצים/mL של ההשעיה. הכפל את הערך ביצים/mL מתקבל על ידי הנפח של המתלה הביצה משלב 4.8. זוהי ההערכה עבור המספר הכולל של ביצים זיון.