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Environment

Reproduzierbare DsRNA Mikroinjektion und Eiablage Bioassay in Mücken und Stubenfliegen

Published: November 08, 2018
doi:
10.3791/58650
, , , ,
1USDA/ARS Center for Medical, Agricultural, and Veterinary Entomology, 2CMAVE Detachment,Navy Entomology Center of Excellence, 3Lovelace Respiratory Research Institute

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroinjektion Methodik, die wir standardisiert und für mehrere Jahre verwendet, um bestimmte Mengen von Nukleinsäuren liefern direkt an die Hämolymphe von Mücken und Stubenfliegen. Dieses Protokoll führt zu minimalen Injektion Sterblichkeit und ermöglicht Dosismessungen korreliert der Fruchtbarkeit.

Abstract

Synthetische DsRNAs, verwendet, um RNA-Interferenz, induzieren kann Dosis abhängige phänotypischen Auswirkungen haben. Diese Effekte sind schwer zu definieren, wenn die DsRNAs mit einer nicht-quantitative Methode geliefert werden. Pünktliche Lieferung von bekannten Größen der Nukleinsäuren oder andere Chemikalien ist entscheidend für die Wirksamkeit der zu testenden Substanz zu messen und zuverlässigen Vergleich zwischen Verbindungen zu ermöglichen.

Hier bieten wir eine reproduzierbare, quantitative Mikroinjektion-Protokoll, das sorgt für pünktliche Lieferung von bestimmten Dosen von DsRNA, Verringerung der Sterblichkeit in der Regel durch Injektion Schädigung induziert. Diese Änderungen umfassen die Zugabe von Rhodamin B, eine abgestufte Injektionsnadel und eine verbesserte Wiederherstellungsmethode entlehnt Isoe und Collins. Diese Methode erlaubt die Berechnung der Dosis Antworten und ermöglicht Vergleiche zwischen den Verbindungen. Versionen dieser Methode wurden erfolgreich auf drei Gattungen von Mücken sowie Stubenfliegen zur Reduzierung in Fruchtbarkeit aus Gen-silencing der ribosomalen RNA-Transkripte zu beurteilen.

Dieses Protokoll bietet Strategien um mehrere Herausforderungen von kleinen Insekten Mikroinjektion zu reduzieren. Zusammen, mechanische Lieferung von DsRNAs begleitet von visuellen Überprüfung, Identifikation der effektive Standorte für die Lieferung und die Einbeziehung der eine Erholungsphase nach der Injektion zu gewährleisten exakte Dosierung und geringe Verletzungen Mortalität. Dieses Protokoll beschreibt auch eine Eiablage Bioassay zur einheitlichen Bestimmung der Auswirkungen auf die Fruchtbarkeit.

Introduction

Kleine Biomoleküle, wie Nukleinsäuren, Erwachsene Dipteren liefern erweist sich in der Culicidae und Muscidae Herausforderung darstellen. Oraler Einnahme von DsRNAs wurde berichtet, zu produzieren, Sterilität (wenn ausschließlich Gene targeting in Hoden erwachsener ausgedrückt) und Mortalität (wenn SNF7 und ein Steroid-Rezeptor-Coactivator targeting) im Larvenstadium Aedes Aegypti1,2 . Sterblichkeit wurde auch beobachtet, bei der HSP70 in Larven Musca DomesticaAusrichtung auf3. Solche phänotypischen Auswirkungen führten jedoch nicht nach der Fütterung DsRNA zu Erwachsenen Ae. Aegypti in Zucker Mahlzeiten4,5.

Mikroinjektion wurde verwendet, um den Mitteldarm zu umgehen, bei der Einführung von Krankheitserregern oder Nukleinsäuren, so induzieren eine systemische Reaktion5,6,7,8,9,10 . Verschiedene Techniken der Mikroinjektion vorhanden, mit Ausrüstung von Inhouse produziert Apparate, die optische Messung der Einspritzmenge, Mikroprozessor-gesteuerte Injektoren erfordern, die für automatisierte Volumen Lieferung so niedrig wie 2.3 ermöglichen nL 5 , 9 , 10 , 11. RNA-Interferenz (RNAi) Trigger targeting ribosomale mRNAs stören Eierstock Entwicklung in Arthropoden so vielfältig wie die Rinder Zecke Rhipicephalus Microplus, die Moskitos Aedes Aegypti und Culex Pipiens, und die Stubenfliege Musca Domestica5,9,12,13. In diesen Studien war die Überwachung der Störung der Eiablage wesentlich für die Bestimmung der Wirksamkeit von die titanhaltigen wie der Phänotyp als Beendigung oder Verringerung der Nachkommen manifestieren kann. Dies ist eine Form der Mehrgenerationen tödliche Phänotyp, der eine kritische und gewünschte Wirkung in vielen der nichttraditionellen Biocontrol Methoden wie Wolbachia –infizierte Männer Einführung (sexuelle Inkompatibilität) und RNAi induzierte Sterilität5 ,9,14. Tracking-Sterblichkeit und Fruchtbarkeit ist notwendig für die Charakterisierung und Entwicklung von hochspezifischen Biorationals (natürlich vorkommende Krankheitserreger und/oder natürliche Derivate)15.

Dieses Protokoll stellt Detaillierte Mikroinjektion Techniken für Erwachsene Mücken und Stubenfliegen; ein Prozess, der oft nicht gut in der Literatur beschrieben ist. Darüber hinaus werden die Eiablage Bioassay Methoden angemessen bewerten DsRNA Auswirkungen auf Erwachsene Dipteren beschrieben. Diese Protokolle wurden speziell für Aedes Aegypti und Musca Domestica entwickelt aber für andere Arten geändert werden können.

Protocol

(1) Insekt Vorbereitung Betäuben Sie Mücken durch kühlen sie bei 4 ° C für mehrere Stunden oder 2 min Exposition gegenüber CO2 und dann bei 4 ° C vor Injektionen halten. Fliegen bei 4 ° C 2\u20123 h vor Injektionen kalt zu betäuben. Mücken und fliegen sind gedeckt, wenn die Eiablage ist eine Antwortvariable zu gewährleisten.Hinweis: Die Moskito-Anesthetization-Methode hängt von der Art und Sorte, z.B. Culex erholen sich viel schneller aus kalten Anesthetization als Aedes Aegypti und CO2 Zuschlag deshalb vorzuziehen. Auf dem Eis ausgesetzt sorgfältig Bühne Mücken oder fliegen mit weichen Zange, um ventral zu legen auf Mikroskop Folien ~0.5 cm auseinander. Standard Folien können zwei Reihen von 6 Mücken halten oder 6 – 7 Haus fliegt. Lassen Sie 1-1,5 cm Platz am linken oder rechten Ende frei von Mücken oder fliegen Folie Umgang mit Hilfe der Folie. Halten Sie Folien inszenierte Insekten bei 4 ° C in großen Petrischalen bis bereit zur Injektion.Hinweis: Bohren ein Loch durch die Petrischale Deckel hilft verhindern, dass Insekten durch Luftverdrängung gestört, wenn Begrenzung. Folien auf ein paar Glaskapillaren Gericht unten gesichert Platzierung erleichtert die Entfernung von Petrischale. (2) Insekt Injektion Bereiten Sie DsRNA vor, wie von Estep Et Al. beschrieben 5 und Sanscrainte Et al. 9. Wenn Sie frei von Verunreinigungen, DsRNA quantifiziert werden kann mit einem Spektralphotometer zur Messung der Absorption bei 260 nm und Berechnung des RNA-Konzentration in μg/mL als ein260 × Verdünnung Faktor × 40. Richten Sie sezieren Mikroskop und Microinjector über eine chill Tisch oder flachen Eiskübel Injektionen auf die Kälte betäubt Mücken und fliegen (siehe Schritt 1.1-1.3 und Abb. 1) durchführen. Ziehen Sie Glaskapillaren zu einer feinen Spitze mit Nadel Abzieher (Einstellungen: Heizung = 15 Einheiten, Magnetventil = 4 A).Hinweis: Siehe Tabelle der Materialien für Herstellerangaben. Legen Sie die Kapillare Nadel in eine Microinjector gemäß den Anweisungen des Herstellers und Pause Nadelspitze durch Kneifen mit einer Zange, eine scharfe Spitze zu produzieren.Hinweis: Empfohlenen Nadeldicken Öffnung sind ~ 150 µm für Moskito und ~ 250 µm für Stubenfliege. Set Microinjector für gewünschte Liefermenge. Meniskus-Bewegung von ~ 50 nL Aliquote ist leicht beobachtbar und empfohlen für Moskito Mikroinjektionen. Falls verfügbar, aktivieren Sie schnelles Einspritzen Einstellungen. Spülen Sie die Nadel durch das Ausfüllen und Vertreibung Nuklease-freies Wasser 3mal. Bereiten Sie Lösungen für Injektion bei einer Konzentration bieten so, dass 100\u2012150 nL gewünschte Dosis für Mücken und 500 nL Willen Dosis für Stubenfliegen gewünscht vor.Hinweis: Vorgeschlagen Initialdosen: 1 µg für jede Mücke und 5 µg für jede Stubenfliege5,9. Optional für Moskitos, fügen Sie Rhodamin B (in der Visualisierung zu unterstützen) hinzu, Lösungen auf eine Endkonzentration von 3,0 µg/mL.Hinweis: Der Farbstoff werden nach der Injektion durch die fast klare Nagelhaut auf der ventralen Oberfläche an der Kreuzung der Abdomen/Thorax deutlich sichtbar durch seine rosa Farbe. Pipette 3 – 4 µL Lösung injizieren auf eine saubere Unterlage (z. B. ein Stück Paraffin Film) und ziehen in die Glasnadel ohne jegliche Luft ansaugen. Drücken Sie die Schaltfläche “Inject” wiederholt, bis Flüssigkeit beginnt zu verzichten, von der Nadel und Tröpfchen mit einer heiklen Aufgabe Wischer vorsichtig abwischen.Hinweis: Während einige Modelle der Microinjectors Verfüllung der Spritze benötigen, ist dies nicht der Injektor in der Tabelle der Materialien verwiesen wird. Zeichnen Sie mit einem ultra-feinen Spitze Marker Hash-Zeichen ~ 1 mm auseinander ausgehend von der flüssigen Meniskus auf den Nadel-Schaft. Bei der Visualisierung der Meniskus-Bewegung zu unterstützen wird und sicherzustellen, dass die Lösung die Mücke beim Einspritzen eingetreten ist. Legen Sie die Folie der Mücken oder fliegen (wie in Schritten 1,2 – 1,3 vorbereitet) unter der Nadel auf den chill Tisch oder Eis (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass Gesichtsfeld im Mikroskop ist breit genug, um die Lösung Meniskus in der Nadel zu sehen. Für Mücken, richten Sie die Nadel mit der mittleren Drittel des Mesokatepisternum (Abbildung 2A) und während Verstrebungen die Mücke gegen die Nadel mit der Pinzette auf der gegenüberliegenden Seite platziert, Punktion vorsichtig die Nagelhaut mit der Nadel Tipp mit der Microinjector Mikrometer. Richten Sie für Stubenfliegen die Nadel mit dem Mesopleuron (Abb. 2 b), und während die Fliege gegen die Nadel Verstrebungen, Durchstechen Sie vorsichtig die Nagelhaut mit der Nadelspitze. Vorsichtig schieben Sie die Nadel in die Mücke oder fliegen Sie Körper zu, bis die Spitze der Mittellinie durchlaufen hat.Hinweis: Die eingespritzte Flüssigkeit Sicke aus das Insekt führt oft zu flach Nadel einsetzen (siehe Schritt 2.15). Drücken Sie beim betrachten für die Bewegung des flüssigen Meniskus in der Nadel Spritzen Taste bis die gewünschte Menge an Flüssigkeit gespritzt worden. Für Mücken wenn auf 50,6 nL Aliquote eingestellt, drücken Sie 2 X für ~ 100 nL oder 3 X für ~ 150 nL. Für Stubenfliegen, drücken Sie die Schaltfläche “Inject” bis ~ 500 nL injiziert wurde (d. h. mit 69 nL Aliquote drücken 7 X 483 nL). Wenn der Meniskus nicht bewegt, langsam schieben Sie die Mücken oder fliegen von der Nadel gleiten, während gerade für Meniskus Bewegung. Wenn ein Teil der injizierten Lösung Perlen aus der Kutikula auf Nadel entfernen oder wenn der Meniskus nicht zu bewegen, verwerfen das Insekt als gelang diese Injektion nicht. Übertragung erfolgreich eingespritzte Mücken in Gruppen von 10-15 oder Stubenfliegen in Gruppen von 5 bis 3,5 oz holding Tassen klar. Mit Tüll oder Netze abdecken und bei Raumtemperatur zu erholen. Nach Mücken und fliegen (1 – 2 h) erholt haben, kehren Sie jede Tasse halten über einen mit 10 % Saccharose-Lösung getränkten Wattebausch.Hinweis: Die Umkehrung des Cups auf der Oberseite der Saccharose Baumwolle unterstützt überleben durch den einfacheren Zugang zu einem Zucker essen10. Spülen Sie die Nadel wie in Schritt 2.5 zwischen Injektionslösungen. Wenn fertig, Injektion, verwendet verwerfen Nadeln in eine entsprechende Scharfbehälter. 3. Aedes Aegypti Sterblichkeit und Eiablage Bioassay Für drei Tage nach der Injektion weiterhin bieten Mücken mit 10 % Saccharose und notieren Sie die Anzahl der sichtlich tote Mücken. Füllen Sie eine künstliche ≤12-Zoll-Membran (z. B. Kollagen Wursthülle) mit frischem Blut (z. B. Rinder für Aedes Aegypti) und Hitze bis 60 ° C im heißen Wasserbad. Kurz trocknen Sie die Membran durch Walzen auf einem Papiertuch und legen Sie über die Tüll-Kappen der 3,5 oz klar halten Tassen. Zur Verbesserung der Fütterung spike Blut mit 1 mM ATP nach dem erwärmen als eine Phagostimulant oder durch Griff der erwärmten Blutwurst mit sauberen Händen, menschliche flüchtigen Stoffen auf die Oberfläche des Gehäuses zu verlassen. Ersetzen Sie nach Blut füttern den Wattebausch getränkt mit 10 % Saccharose auf die Abhaltung Tassen und Mücken ~ 24 h ruhen vor der Übertragung zu Eiablage Tassen. Konstrukt Eiablage Tassen füllen deaktivieren 3,5 oz Bioassay Tassen mit ~ 30 mL entionisiertem H2O und Platzierung eines Stückes Samen keimen Papier (~ 4 cm breit und 5 cm lang, mit Rippen vertikal) an der Unterseite des Bechers und gegen die Seite (Abbildung 3A) . Mit Tüll oder Netze abdecken und in Tüll oder Aufrechnung GAP einen kleinen Schlitz (~ 1 cm) geschnitten. 24 h nach dem Blut zuführen, schneiden einen kleinen Schlitz (~ 1 cm) in der Tüll Kappe des Holding-Cup und übertragen nur einzelne Frauen, die erfolgreich gefüttert – mit einem Bolus sichtbar Blut im Bauch – durch sanften Mund Absaugen in Eiablage Tassen (1 weiblich/Eiablage Tasse). Den kleinen Schnitt in der Eiablage-Kappe mit einem 10 % Saccharose gesättigten Wattebausch zu versiegeln. Halten Sie Tassen ~ 27 ° c für 5\u20127 Tage, um Moskitos voll oviposit während tägliche Sterblichkeit tracking ermöglichen. Anzahl Eier sezierenden Rahmen. 4. Musca Domestica Sterblichkeit und Eiablage Bioassay Für drei Tage nach der Injektion weiterhin bieten die fliegen mit 10 % Saccharose und notieren Sie die Anzahl der sichtlich Tote fliegen. Betäuben Sie drei Tage nach der Injektion, fliegen indem man kurz ein Polyethylenschlauch Abgabe CO2 über die Holding-Cups, bis alle fliegen am Rand der Schalen unbeweglich sind. Übertragen Sie fliegen auf einem sauberen Käfig bestehend aus 4 L-Kunststoff-Glas mit einem gestrickten Ärmel über die Öffnung (10 cm, Abbildung 3 b). Geben Sie fliegen mit Wasser und eine Mischung aus Kristallzucker Saccharose, Milchpulver und getrocknete Eigelb in einem 8:8:1-Verhältnis (nach Volumen) für vier Tage, Aufnahme und Entfernen von Toten fliegt täglich. Bereiten Sie trockene Zutaten durch das Mischen von 75 % Weizenkleie mit 25 % pelleted Tierfutter nach Gewicht frische Fliege Larven Aufzucht Medium vor. Fügen Sie Wasser hinzu, um 62 % Feuchtigkeit (bis ein Tropfen Wasser kaum ausgepresst werden kann) zu erreichen. Bereiten Sie eine 2,5 cm Durchmesser Kugel aus einer 1:1 Mischung aus den oben genannten frische Larven Medien und “verwendet” fliegen Larven Medium (Mittel in dem fliegen haben bisher pupated). Wickeln Sie den Ball in ein Quadrat aus schwarzem Baumwollstoff, drücken Sie leicht bis mittlere Flüssigkeit durch sickert, dann verwenden Sie Gummibänder um das Tuch um den Ball zu halten. Legen Sie den Ball in einer 60 mL Tasse und legen Sie sie in die Fliege Käfig für 5 h (Abb. 3 b). Spülen Sie Eier auf die Eiablage Ball und sicherzustellen Sie, dass die Eier unter Falten im Tuch entfernt werden. Schütteln Sie Eier zu Clustern zu stören und übertragen Sie sie auf eine abgestufte 20 mL Zentrifugenröhrchen mit einem Transferpipette. Warten Sie, bis die Eier zu begleichen und beachten Sie die Lautstärke der sesshaften Eier in der abgestuften Röhre. Fügen Sie ausreichendes Wasser, um das Volumen bis zu 20 X die Menge der abgerechneten Eier bringen. Notieren Sie das Gesamtvolumen des Wassers sowie Eier. Beim Mischen von Wasser und Ei Federung mit einem magnetischen Stir Bar oder kräftig rühren, verwenden Sie eine 1 mL Pipettieren Spitze (mit dem Ende der Spitze abgeschnitten), 0,5 mL der Suspension Wasser und Ei auf ein Stück vorbefeuchteten schwarzes Tuch in einer Reihe von Zeilen zu verzichten. Zählen Sie die Eier unter dem sezierenden Mikroskop. Wiederholen Sie Schritt 4,9 zwei weitere Male. Wenn einer der Grafen einen schweren Ausreißer ist (d. h. unterscheidet sich von den anderen zwei Grafen von > 35 %), machen Sie eine vierte zählen und Missachtung der Ausreißer. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl Eier pro Probe und multiplizieren Sie diesen Wert mit 2 um die Anzahl der Eier/mL der Suspension zu erhalten. Multiplizieren Sie die Eier/mL Wert, der durch das Volumen der Ei-Suspension aus Schritt 4.8. Dies ist die Schätzung für die Gesamtzahl der Eier gelegt.

Representative Results

Mikroinjektion von DsRNA in Mücken Diese Mikroinjektion-Methode wurde in unserem Labor zur Genexpression, Sterblichkeit und Eiablage Antwort für über 80 DsRNA Trigger über mehrere Moskito Gattungen (Aedes, Anopheles, Culex) zu bewerten. Injektion von Frauen aus dem Stamm der Kolonie von Ae. Aegypti (ORL1952) mit 1 µg der DsRNA abgeleitet die ribosomale Transkripte RPS6 und RPL26 (siehe Estep Et al. 5 für DsRNA Produktionsmethoden und Sequenzdaten) zeigten eine signifikante Verringerung der relativen Ausdruck (RE) über mehrere Eiablage Zyklen im Vergleich zu Mücken mit einem Steuerelement DsGFP injiziert. Aedes aegypti RE nach der 2Nd Gonotrophic Zyklus gemessen zeigten signifikante Reduktion der RPS6 Ausdruck (P < 0,05) in Mücken gespritzt mit dsRPS6 bestimmt ein Student t-Test zwischen der DsGFP von der gleichen Gruppe (Abbildung 4)5 . Fruchtbarkeit war aus einzelnen Weibchen mit der Eiablage Bioassay beschrieben hier bewertet. Nach 3 Tagen nach der Injektion gab Mücken Blut zugeführt, in einzelnen Eiablage Behälter überführt und erlaubt, bis zur Fertigstellung zu legen. Durchschnittliche Kupplung Größen für den ersten Zyklus der Gonotrophic wurden signifikant reduziert, für beide dsRPS6 Ae. Aegypti behandelt (n = 102 Frauen, 1,3 ± 0,8 (Mittelwert ± SE) Eier) und dsRPL26 behandelt (n = 86 Frauen, 4,0 ± 1,1 Eier) im Vergleich zu DsGFP Injektionen (n = 79 Weibchen, 49,3 ± 3,5 Eier, Abb. 5A). Kupplung Bewertung nach einem zweiten Gonotrophic Zyklus zeigte auch deutlich reduzierten Eiablage für beide Gruppen DsRNA behandelt, aber mit reduzierten Effektgröße. Gruppengrößen von Ae. Aegypti waren variabel und somit bedeutet Trennung von Dunn’s Test5durchgeführt. 24-Stunden-Sterblichkeit war in der Regel 3 % oder weniger. Eine klare Dosis-Wirkung wurde beobachtet, bei der Injektion von dsRPS6 von 1 µg bis 50 ng in weiblichen Ae. Aegyptiund Kupplung Größe sehr unterschiedlich im Vergleich zu 1 µg/weiblich DsGFP injiziert Kontrollen in allen außer den 25 ng/weiblich dsRPS6 Dosis (Abbildung 5 b). Mikroinjektion von DsRNA im Haus fliegt Kolonie Musca Domestica (ORL normal) wurden mit 5 µg DsRNA Konstrukte entwickelt gegen die Stubenfliege RPS6 und RPL26 Protokolle9injiziert. Wie in Ae. Aegyptibeobachtet wurde, deutliche Verringerung der sowohl spezifische Protokoll-Ausdruck (RPS6 und RPL26) und Verkleinerung Kupplung (Abbildung 4 und Abbildung 5A) beobachtet. Signifikante Reduktion in RE wurde von Studenten t-Test zwischen der DsGFP von der gleichen Gruppe bestimmt (P < 0,05) und Holm-Sidak Test wurde zur Ermittlung der Bedeutung zwischen Kupplung Größen für verschiedene M. Domestica Behandlungsgruppen. Eierstöcke Sezierungen zeigte reduzierte Oogenese in dsRPS6 und dsRPL26 Behandlungen, während DsGFP Fliegen gefüttert normal Vitellogenin Ablagerung hatte auf den Tyndale-Biscoe Skala9bewertet. Abbildung 1: Mikroinjektion Setup für die Bereitstellung von Microvolumes für Erwachsene Mücken und Stubenfliegen. Injektionen werden bei Kälte betäubt Insekten inszeniert auf Objektträger über einen chill Tisch durchgeführt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2: Mikroinjektion Standorte für Ae. Aegypti und M. Domestica. (A) Erwachsenen Ae. Aegypti werden in das mittlere Drittel der Mesokatepisternum injiziert. (B) Erwachsene M. Domestica werden in den Mesopleuron injiziert. Pfeile zeigen die Standorte der Injektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3: Eiablage Bioassay Setup. (A) Ae. Aegypti Eiablage Assay Tassen mit Samen keimen Papier als Eiablage Substrat, mit Tüll und 10 % Saccharose-getränkten Baumwoll begrenzt. (B) Erwachsenen weiblichen M. Domestica in einem Eiablage-Assay-Behälter mit Essen (A), Wasser (B) und Larven Medien (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 4: Relative Ausdruck RPS6 in Ae. Aegypti und M. Domestica mit artspezifische DsRNAs injiziert. Aedes Aegypti und M. Domestica wurden mit 1 und 5 µg bzw. der beiden Kontrolle DsRNA (DsGFP) injiziert oder DsRNA entwickelt gegen RPS6 oder RPL26 Abschriften von jedem Insekt. Signifikante (P < 0,05) der RPS6 Ausdruck verzeichneten Mücken und fliegen injiziert mit dsRPS6 und von Fliegen mit dsRPL26 (durch Sternchen gekennzeichnet) injiziert. Fehlerbalken Mittelwert ± SE dar, die Zahl in der Spalte Basis zeigt Anzahl der Individuen untersucht. Diese Zahl wurde von Estep Et Al. modifiziert 5 und Sanscrainte Et al. 9. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 5: Durchschnittliche Gelegegrösse Ae. Aegypti und M. Domestica mit artspezifische DsRNAs injiziert. (A) Eiablage wurde deutlich reduziert (P < 0,05) in Ae. Aegypti und M. Domestica nach Injektion von 1 bis 5 µg bzw. der beiden Kontrolle DsRNA (DsGFP) oder DsRNA gegen RPS6 oder RPL26 Transkriptionen von jedem Insekt entwickelt. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede von der DsGFP-Kontrolle von der gleichen Gruppe. Fehlerbalken Mittelwert ± SE dar, die Zahl in der Spalte Basis zeigt Anzahl der Individuen untersucht. Diese Zahl wurde von Estep Et Al. modifiziert 5 und Sanscrainte Et al. 9. (B) Dosis Kurve von Ae. Aegypti injiziert mit dsRPS6 von 50 ng/weiblich zu 1000 ng/weiblich zeigt erhebliche Reduzierungen in Fruchtbarkeit im Vergleich zu DsGFP injiziert Kohorten (50, 100 und 1000 ng/weiblich). Fehlerbalken darzustellen Mittelwert ± 95 % CI von 36-81 einzelner Organismen pro Dosis. Punkte mit Buchstaben darstellen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen (P < 0,05) von ANOVA identifiziert. Diese Zahl wurde von Estep Et Al. modifiziert 5. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Mikroinjektion ist eine wertvolle Labortechnik, um Lieferung von DsRNA oder andere Biorationals (z. B. Pestizide, Viren, Mikrosporidien) zu gewährleisten. Während viele Labors Mikroinjektion durchführen, ist die genaue Menge injiziert oft unklar aufgrund technischer Einschränkungen der Liefersystem wo gelieferten Datenträger nicht direkt gemessenen11. Gelieferte Menge und Konzentration sind wichtige Parameter, die Berechnung der toxikologischen Standardmaßnahmen wie EC50 oder IC50 oder legen Sie minimale effektive Dosen5,16. Dies ist besonders wichtig bei funktionellen Studien mit RNAi in Erwachsenen Insekten, wo Lieferung durch die Fütterung ergibt sich nicht immer in der systemischen Exposition auf die gewünschten Partikel und die tatsächliche Dosis überqueren den Mitteldarm ist unklar5.

Während die Mikroinjektion Verfahren zunächst schwierig sein kann, sind rasche Verbesserungen in der Geschwindigkeit und Genauigkeit mit etwas Übung und Geduld erreicht. Die Injektion selbst zu meistern ist eine Investition, aber einmal erreicht, die Prozedur erzeugt wiederholbare Ergebnisse und Verletzungen Mortalität von < 3 %. Das Verhältnis von erfolgreichen Injektionen wird mit zunehmender Kompetenz ermöglicht Injektion von 300 Moskitos erhöht oder fliegt pro Tag.

Viele der Herausforderungen der Mikroinjektion sind aufgrund der Nadel verwendet wird. Bestimmung der richtigen Kapillare Nadel Haltepunkt und Spitzenwinkel ist ein herausfordernder Aspekt des Verfahrens und erfordert einige Versuch und Irrtum die effektivste Eröffnung Größe für eine gegebene Art bestimmen. Die feine Nadel am nützlichsten für die Mücke Mikroinjektion (~ 150 µm) ist zu klein, um das größere Volumen injiziert fliegen während umgekehrt die größeren Nadel öffnen, dass Werke auf fliegen (~ 250 µm), die kleinere Mücken umfangreiche Verletzungen Schäden verursacht schnell zu liefern und inakzeptabel Injektion Mortalität. Eine Nadel mit einer stumpfen Spitze gebrochen ist oft schwierig, durch die Kutikula ohne Gewebeschäden und einer erhöhten Sterblichkeit. Insekt Skalen oder Gewebe Stücke können Nadeln im Laufe eines Experiments verstopfen, so ist es oft hilfreich, wenn mehrere Nadeln gezogen wenn ersetzt werden muss. Wir haben festgestellt, dass es einfacher, eine schwierige Nadel ersetzen, anstatt Zeit zu versuchen, eine gestaute oder verschmutzt Nadel klar.

Beobachtung der Injektionslösung betreten das Insekt ist entscheidend, so dass erfolglose Injektionen (siehe Schritte 2.14 2.15) entfernt werden können. Rhodamin B Ergänzung Injektionslösungen bietet eine klare visuelle um sicherzustellen, dass Kälte inszenierte Insekten erhalten, richtige Dosierung und ist besonders hilfreich beim üben (siehe Schritt 2.7).

Injektion und Eiablage Bioassay vorgestellten Methoden hier haben erfolgreich induziert gen Knockdown und messbare phänotypische Effekte in Erwachsenen Ae. Aegypti und M. Domestica mit DsRNAs gegen arteigene ribosomale gestaltet Transkripte (Abbildung 4 und Abbildung 5A). Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit dieser Methode genau Microvolumes an Privatpersonen liefern Dosis-Wirkungs-Kurven für kleine Mengen von Material erzeugt werden sollen (so niedrig wie 50 ng; Abbildung 5 b). Dies ist besonders nützlich für Methoden wie screening SiRNAs oder DsRNAs, als große Mengen dieser Moleküle können kostspielig sein.

Diese Methode kann geändert werden, um biologische Arbeitsstoffe (Viren, Bakterien, Mikrosporidien) oder chemische Pestizide, nachdem Sie sichergestellt haben, dass jede Lieferung Puffer harmlos sind durch Injektion zu injizieren. Wie Liefermenge, von der Größe des Insekts begrenzt ist, Herstellung konzentriert ist Testlösungen von Bedeutung.

Um angemessen DsRNA Wirksamkeit bewerten, ist es notwendig, die Eiablage zu verfolgen, wie tödlichere Phänotypen nur in Nachkommen manifestieren können. Wie hier dargestellt, weibliche Ae. Aegypti getrennt nach geblutet zu halten erlaubt individuelle Kupplung Größenbestimmung und weitere Tests auf die gleichen Personen kann erfolgen nach der Eiablage (d. h. Genexpressionsstudien, zusätzliche Gonotrophic Zyklen, Gewebe spezifische Zuschlag) Reproduktionsleistung mit anderen Maßnahmen wie der Genexpression zu korrelieren. Wie M. Domestica oviposit in der Regel in einer Gruppe Antwort, ist Anstiftung zu isolierte trächtige fliegen legen sehr arbeitsintensiv und nicht praktisch für eine große Zahl von Einzelpersonen17. Daher ist eine Methode zur Bestimmung der durchschnittlichen Gelegegrösse vorgestellt.

Die hier vorgestellte Methode der Mikroinjektion bietet eine konsistente systemische Zustellung in Mücken und Stubenfliegen. Gepaart mit Sterblichkeit und Eiablage Bioassays verfolgen, diese vielseitigen Tools lässt sich die transkriptionelle und phänotypischen Auswirkungen der kleine RNA-Moleküle, biologische Arbeitsstoffe und traditionellen Pestizide wo mündlichen Lieferung ist nicht lebensfähig.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Hanayo Arimoto (US Navy), Dana Johnson, Lucy Li und Roxie White (USDA-ARS) für Hilfe bei Datenerfassung und Analyse. Wir danken Dr. Pia verzögernd (USDA-ARS) und Ke Wu (Universität von Florida) für kritische Durchsicht des Manuskripts und Niklaus Hostettler (Universität von Florida) für die Dreharbeiten der Mikroskop-Aufnahmen. Finanzierung wurde von der USDA, das WII – 141 C-Projekt von der Navy und Marine Corps Public Health Center und bereitgestellt Krieg Kämpfer Schutzprogramm bereitgestellt. Die Geldgeber hatten keine Rolle bei der Gestaltung und Entwicklung des Manuskripts oder Richtung der Studie.

Materials

needle pulling
vertical pipette puller Kopf 720 settings: heater = 15 units, solenoid = 4 amps
glass capillaries, 3.5" long, ID = 0.530 mm ± 25 μm, OD 1.14 mm World Precision Instruments 504949 capillaries for pulling glass needles
Name Company Catalog Number Comments
microinjector station
Nanoliter 2010 World Precision Instruments NANOLITER2010 microinjector
manual micromanipulator World Precision Instruments KITE-L left hand KITE manipulator
magnetic stand World Precision Instruments M9 holds micromanipulator
precision stereo zoom binocular microscope on boom stand World Precision Instruments PZMIII-BS dissecting scope for microinjections
1.5X objective World Precision Instruments 501377 objective for microscope
light LED ring World Precision Instruments 504134 light ring for injection microscope
laboratory chill table BioQuip Products 1431 chill table for microinjections
microscope slides Fisher Scientific 12-544-1 for staging insects while injections
Rhodamine B, 98+% Acros Organics AC296571000
Name Company Catalog Number Comments
mosquito oviposition bioassays
large Petri dish Fisher Scientific FB0875714 for holding staging slides
plastic cup – 3 1/2 oz. Dart Container Corporation TK35 mosquito oviposition bioassay cups
matte tulle fabric Joanne Fabrics 1103068 caps for oviposition bioassays
blood source locally acquired typically bovine or live chickens
1 x 30mm clear edible collagen casing Butcher and Packer 30D02-05
heavy weight seed germination paper Anchor Paper Co SD7615L
oral aspirator with HEPA filter John W. Hock Company 612
Name Company Catalog Number Comments
house fly oviposition bioassays
4 L plastic food storage canister Walmart 555115143
10-inch stockinette sleeve Medonthego.com FS15001H
wheat bran locally acquired typically found at feed stores
Calf Manna performance supplement ValleyVetSupply.com 16731 pelleted livestock feed
dried egg yolk BulkFoods.com 40506
black cotton cloth locally acquired typically in craft supplies section
60 mL cup Dart Container Corporation P200-N
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Sanscrainte, N. D., Waits, C. M., Geden, C. J., Estep, A. S., Becnel, J. J. Reproducible dsRNA Microinjection and Oviposition Bioassay in Mosquitoes and House Flies. J. Vis. Exp. (141), e58650, doi:10.3791/58650 (2018).
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