Reproduceerbaar dsRNA Microinjection en Oviposition Bioassay in muggen en huis vliegt

1. insect voorbereiding Anesthetize muggen door hen bij 4 ° C koeling gedurende enkele uren of door 2 min blootstelling aan CO2 en vervolgens houden bij 4 ° C vóór injecties. Koude anesthetize vliegen bij 4 ° C 2\u20123 h vóór injecties. Zorgen dat muggen en vliegen zijn gekruist als oviposition de variabele van een reactie.Opmerking: De mug afstomping methode is afhankelijk van de soort en stam, bijvoorbeeld Culex herstellen sneller van koude afstomping dan Aedes aegypti en CO2 knockdown daarom beter. Op het ijs, zorgvuldig fase muggen of vliegen met behulp van zachte pincet te leggen hen ventrally blootgesteld op Microscoop dia’s ~0.5 cm uit elkaar. Standaard dia’s kunnen bevatten twee rijen van elk 6 muggen of 6-7 huis vliegt. Laat een 1 – 1,5 cm ruimte aan het einde van het links of rechts van de dia duidelijk van muggen of vliegt naar steun dia behandeling. Houd slides van gefaseerde insecten bij 4 ° C in grote petrischalen tot klaar voor de injectie.Opmerking: Boren van een gat door het deksel van de petrischaal zal helpen voorkomen dat insecten door lucht verplaatsing worden verstoord wanneer Plafonnering. Plaatsen van dia’s op een paar glazen capillairen bevestigd aan de onderkant van de schotel zal verlichten afgehaald petrischaal. 2. insect injectie DsRNA bereiden zoals beschreven door Estep et al. 5 en Sanscrainte et al. 9. als vrij van verontreinigingen, dsRNA kan worden gekwantificeerd met behulp van een spectrofotometer voor het meten van de absorptie bij 260 nm en berekening RNA concentratie in μg/mL als een260 × verdunning factor × 40. Instellen ontrafeling van Microscoop en microinjector over een chill tabel of ondiepe ijsemmer voor het uitvoeren van injecties op de koude-verdoofd muggen en vliegen (zie stap 1.1-1.3 en Figuur 1). Trek glas haarvaten naar een fijne tip met de trekker van de naald (instellingen: kachel = 15 eenheden, solenoïde = 4 A).Opmerking: Zie Tabel van materialen voor details van de fabrikant. Plaats de capillaire naald in een microinjector volgens de instructies van de fabrikant en de pauze naald tip door te knijpen met een paar pincet te produceren van een scherpe punt.Opmerking: Voorgestelde naald opening maten zijn ~ 150 µm voor muggen en ~ 250 µm voor de huisvlieg. Microinjector voor gewenste levering volume instellen Meniscus beweging van ~ 50 nL aliquots is gemakkelijk waarneembare en aanbevolen voor mosquito microinjections. Indien beschikbaar, snelle injectie instellingen inschakelen. Spoel de naald door te vullen en uitzetting nuclease-gratis water 3 keer. Oplossingen voor te bereiden voor injectie met een concentratie zodanig dat 100\u2012150 nL zorgt voor gewenste dosis voor muggen en 500 nL wil bieden dosis voor huis vliegt gewenste.Opmerking: Voorgesteld initiële dosis: 1 µg voor elke mug en 5 µg voor elke huisvlieg5,9. Toevoegen optioneel voor muggen, Rhodamine B (op steun in visualisatie) tot oplossingen op een eindconcentratie van 3.0 µg/mL.Opmerking: De kleurstof worden duidelijk zichtbaar door de roze kleur na injectie door de nagenoeg helder cuticle op het ventrale oppervlak op het snijpunt van de buik/thorax. Pipetteer 3 – 4 µL van oplossing te injecteren op een schoon oppervlak (zoals een stuk van paraffine film) en trekken in de naald glas zonder zuigen in de lucht. Druk de knop inject herhaaldelijk totdat de vloeistof begint te afzien van de naald en voorzichtig vegen druppels met een delicate taak wisser.Opmerking: Hoewel sommige modellen van microinjectors backfilling de spuit vereisen, de injector waarnaar wordt verwezen in de Tabel van de materialen niet. Met een ultra-fijne punt marker, tekent hekjes ~ 1 mm uit elkaar vanaf de vloeibare meniscus tot de schacht van de naald. Dit zal helpen bij het visualiseren van de meniscus beweging en zorg ervoor dat de oplossing de mosquito heeft ingevoerd tijdens de injectie. Stel de dia van muggen of vliegen (zoals opgesteld in stappen 1.2-1.3) onder de naald op de chill tabel of ijs (Figuur 1). Zorgen dat gezichtsveld in de Microscoop is breed genoeg om te zien de oplossing meniscus in de naald. Uitlijnen van de naald met de middelste eenderde van de mesokatepisternum (figuur 2A) voor muggen, en terwijl de mug tegen de naald met een tang verkwikkende aan de andere kant geplaatst, voorzichtig doorprikken van de cuticle bestaat met het gebruik van de tip van de naald de microinjector micrometer. Huis vliegt, uitlijnen van de naald met het mesopleuron (figuur 2B) en terwijl de vlieg tegen de naald verkwikkende, voorzichtig doorprikken de cuticle met het topje van de naald. Zachtjes glijd de naald in de mug of vlieg lichaam totdat de tip heeft doorgegeven via de middellijn.Opmerking: Invoegen van de naald te ondiep vaak resulteert in het geïnjecteerde vloeistof beading uit het insect (zie stap 2.15). Tijdens het kijken naar voor verkeer van de vloeibare meniscus in de naald, de invoeren-knop te drukken totdat de gewenste hoeveelheid vloeistof heeft ingespoten. Voor muggen, als ingesteld op 50.6 nL aliquots, druk 2 X op voor ~ 100 nL of 3 X voor ~ 150 nL. Voor huis vliegt, druk op de knop invoeren tot ~ 500 nL heeft ingespoten (dat wil zeggen, met 69 nL aliquots druk 7 X 483 nL). Als de meniscus niet beweegt, langzaam glijden de mug of de naald wegvliegen tijdens het kijken naar voor meniscus beweging. Als een gedeelte van de geïnjecteerde oplossing parels uit de epidermis bij naald verwijdering of indien de meniscus te verplaatsen, gooi het insect als was deze financiële injectie niet succesvol. Succesvol ingespoten muggen in groepen van 10-15 of huis vliegt in groepen van 5 tot en met 3.5 oz kopjes bedrijf duidelijk overbrengen. Bedek met Tule of verrekening en herstellen bij kamertemperatuur. Nadat muggen en vliegen hebben hersteld (1-2 h), omkeren elk kopje bedrijf over een katoenen bal doorweekt met 10% sacharoseoplossing.Opmerking: De inversie van de cup op de top van de sucrose katoen aids in overleving door gemakkelijker toegang tot een suiker maaltijd10. Spoel naald zoals in stap 2.5 tussen injectie oplossingen. Wanneer klaar injecteren, discard gebruikt naalden in een passende slijpsel container. 3. aedes aegypti sterfte- en oviposition bioassay Drie dagen na de injectie, blijven muggen voorzien van 10 gewichtspercenten sacharose en registreren het aantal zichtbaar dode muggen. Vul een ≤12-duim kunstmatige membraan (zoals collageen worst behuizing) met vers bloed (dat wil zeggen, runderen voor Aedes aegypti) en warmte tot 60 ° C in warm waterbad. Kort het membraan droog door te rollen op een papieren handdoek en lag in de Tule caps van de 3.5 oz cups duidelijk te houden. Ter verhoging van voeding, spike bloed met 1 mM ATP na verwarming als een phagostimulant of door de greep de verwarmde bloedworst met schone blote handen te laten van menselijke vluchtige stoffen op het oppervlak van de behuizing. Na bloed voeden, vervangen de katoenen bal doorweekt met 10 gewichtspercenten sacharose bovenop de kopjes bedrijf en laat muggen te rusten voor ~ 24 h vóór de overbrenging aan oviposition cups. Construct oviposition kopjes door te vullen duidelijk 3.5 oz bioassay kopjes met ~ 30 mL gedeïoniseerd H2O en het plaatsen van een stuk zaad kiemkracht papier (~ 4 cm breed en 5 cm lang met ribbels verticaal uitgevoerd) aan de onderkant van de cup en tegen de zijkant (figuur 3A) . Bedek met Tule of verrekening en een kleine gleuf (~ 1 cm) snijden in het GLB Tule of verrekening. Een kleine gleuf (~ 1 cm) in het GLB tulle van het bedrijf-cup op 24u na bloed voeden, gesneden en overdracht alleen individuele vrouwen die met succes gevoed — met een bolus zichtbaar bloed in buik — door zachte mond aspiratie in oviposition kopjes (1 kop van het vrouwtje/oviposition). Stop de kleine snede in de oviposition dop met een 10% sacharose verzadigde katoenen bal. Houd cups bij ~ 27 ° C om muggen te volledig oviposit terwijl het bijhouden van dagelijkse mortaliteit dagenlang 5\u20127. Aantal eieren onder een ontleden. 4. de sterfte en oviposition bioassay Musca domestica Drie dagen na de injectie, blijven de vliegen voorzien van 10 gewichtspercenten sacharose en registreren het aantal zichtbaar dode vliegen. Drie dagen na de injectie, anesthetize vliegen door kort het plaatsen van een polyethyleen buis verstrekking van CO2 over de kopjes bedrijf totdat alle vliegen roerloos aan onderkant van de cups zijn. Overdracht vliegt naar een schone kooi bestaat uit een 4 L plastic pot met een tricotsteek mouw die betrekking hebben op de opening (10 cm, figuur 3B). Vliegen met water en een mengsel van gekorrelde sacharose, melk in poedervorm, gedroogd eigeel in een 8:8:1 verhouding (volumeprocent) voor vier dagen, opname en het verwijderen van dode vliegt dagelijks. Bereid droge ingrediënten voor verse vliegen larvale steigerend medium door het mengen van 75% tarwezemelen met 25% Ingehuld veevoeder gewichtspercenten. Voeg water tot 62% vocht (tot een druppel water kan nauwelijks worden weggedrukt). Bereiden van een 2,5 cm diameter bal uit een mengsel van 1:1 van de bovenstaande vers larvale media en larvale medium “gebruikt” vliegen (medium waarin vliegen hebben eerder pupated). Wikkel de bal in een vierkant van zwarte katoenen doek, squeeze licht tot medium vloeistof sijpelt door, gebruik dan elastiekjes om het doek op zijn plaats rond de bal houden. Zet van de bal in een 60 mL beker en plaats deze in de vlieg kooi voor 5 h (figuur 3B). Spoel van eieren uit de bal oviposition en zorgen dat de eieren onder plooien in het weefsel worden verwijderd. Het schudden van eieren om te verstoren clusters en hen overbrengen in een centrifugebuis afgestudeerd 20 mL met een pipet overdracht. Wacht totdat de eieren regelen en noteer het volume van de vaste eieren in de geijkte buis. Voeg voldoende water om het volume maximaal 20 X het volume van de vaste eieren. Noteer de totale hoeveelheid water plus eieren. Tijdens het mixen de water en ei schorsing met een magnetische roer bar of krachtig roeren, gebruikt u een 1 mL pipet tip (met het einde van de tip afgesneden) af te zien van 0,5 mL van de ophanging van het water en ei op een stuk van vooraf bevochtigd zwarte doek in een reeks lijnen. Tellen de eieren onder een Microscoop ontleden. Herhaal stap 4.9 twee meer tijden. Als een van de graven een ernstige uitschieter is (dat wil zeggen, verschilt van de andere twee tellingen door > 35%), maken een vierde graaf en negeren de uitschieter. Het gemiddelde aantal eieren per monster berekenen en deze waarde vermenigvuldig met 2 te krijgen van het aantal eieren/mL van de schorsing. Vermenigvuldigt de waarde van de eieren/mL verkregen door het volume van de schorsing van de ei uit stap 4.8. Dit is de schatting voor het totale aantal eieren gelegd.