عزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة من الكبد
Summary
هذا هو بروتوكول لعزل الحويصلات خارج الخلية الأنسجة (EVs) من الكبد. يصف البروتوكول عملية من خطوتين تنطوي على التسريب الكولاجيني تليها تفاضلية ultracentrifugation لعزل أنسجة الكبد EVs.
Abstract
يمكن إطلاق الحويصلات خارج الخلية (EVs) من العديد من أنواع الخلايا المختلفة واكتشافه في معظم سوائل الجسم، إن لم يكن كلها. يمكن للمركبات الكهربائية المشاركة في الاتصال من خلية إلى خلية عن طريق إغلاق الجزيئات النشطة بيولوجيا مثل الحمض النووي الريبي أو البروتين من خلية إلى أخرى. وقد أجريت معظم الدراسات من المركبات الكهربائية في نماذج ثقافة الخلايا أو في المركبات الكهربائية معزولة عن سوائل الجسم. وهناك اهتمام ناشئ بعزل المركبات الكهربائية عن الأنسجة لدراسة مساهمتها في العمليات الفسيولوجية وكيفية تغييرها في الأمراض. عزل المركبات الكهربائية مع غلة كافية من الأنسجة هو التحدي من الناحية الفنية بسبب الحاجة إلى تفكك الأنسجة دون ضرر الخلوية. يصف هذا الأسلوب إجراء لعزل المركبات الكهربائية من أنسجة كبد الماوس. وتنطوي هذه الطريقة على عملية من خطوتين تبدأ بهضم الكولاجين في الموقع متبوعة بعملية تفاضلية فائقة الطرد المركزي. التسريب الأنسجة باستخدام الكولاجين يوفر ميزة على القطع الميكانيكيأو تجانس أنسجة الكبد بسبب زيادة غلة المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها. استخدام هذه العملية من خطوتين لعزل المركبات الكهربائية من الكبد سوف تكون مفيدة لدراسة الأنسجة EVs.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات مرتبطة بالغشاء يتم تحريرها من العديد من الأنواع المختلفة من الخلايا في الجسم. تحتوي المركبات الكهربائية على حمولة من الجزيئات التي تشمل الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. يتم تفترض نقل هذه الشحنة من قبل المركبات الكهربائية من خلية إلى أخرى كآلية واحدة من خلالها الخلايا داخل الأنسجة التواصل مع بعضها البعض1. وقد استمدت غالبية المعلومات المتعلقة بالبضائع أو أدوار المركبات الكهربائية في الصحة العادية والأمراض من الدراسات على المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من الخلايا في الثقافة أو التي تم جمعها من الدورة الدموية أو غيرها من سوائل الجسم2. من أجل فهم أدوارهم الفسيولوجية في الجسم الحي، طريقة قوية ضرورية لعزل الأنسجة EVs التي تلتقط جميع السكان من المركبات الكهربائية ويتجنب الضرر الخلوي أو التلوث3. الهدف العام للطريقة الموضحة هنا هو عزل الأنسجة EVs من كبد الماوس.
وقد ثبت أن معظم أنواع الخلايا في الكبد لإنتاج المركبات الكهربائية، ودراسة الإشارات القائمة على EV هو تعزيز المعرفة الأساسية وفهم الأمراض الكبدية. ومع ذلك، فإن التأثير المشترك للمركبات الكهربائية من أنواع الخلايا المختلفة داخل الأنسجة هو مفهوم جزئي فقط. عزل المركبات الكهربائية من أنسجة الكبد ضروري من أجل فهم المساهمات في الموقع من المركبات الكهربائية داخل بيئة الأنسجة. ويستند النهج الموضح هنا على التسريب خطوتين لتعزيز تفكك الأنسجة وتقليل تلف الخلايا. في وقت لاحق، يتم عزل المركبات الكهربائية من أنسجة الكبد المنفصلة. وقد استخدمت النهج التي تستخدم التسريب خطوتين لعزل خلايا الكبد منذ أوائل 1950s4. وقد تم تعديل هذه الأساليب لعزل خلايا الكبد وتحسينها باستمرار، وهي الآن النهج القياسية لعزل خلايا الكبد في الثقافات، في تعليق الخلايا، ومن الأنسجة5،6،7. في الخطوة الأولى، يخضع الكبد لتدفق غير تدوير مع العازلة خالية من الكالسيوم، حل الملح متوازن هانك (HBSS). في الخطوة الثانية، يتم غرس الكبد مع الكولاجين لإذابة المصفوفة خارج الخلية لمزيد من الفصل بين تقاطعات الخلايا إلى الخلايا. وقت العلاج الأمثل لحل الكولاجين هو 7 إلى 10 دقائق. ومدة أقصر من العلاج يسبب حل غير كامل والاحتفاظ باتصالات الخلية في الكبد, في حين أن مدة أطول قد يسبب تلف الكبد أو اضطراب الوريد المدخل. ثم يتم عزل المركبات الكهربائية باستخدام الطرد المركزي التفاضلي لإزالة الخلايا والحطام الخلوي. وهذا يؤدي إلى جمع EV في الغلة العالية التي يمكن استخدامها لمزيد من التحليلات النهائية أو الدراسات.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة أمثل واستنساخ لعزل الأنسجة الكبدية EV باستخدام عملية التسريب خطوتين عبر الوريد المدخل متبوعاً بتواق تفاضلي. وتشمل الخطوات الهامة للإجراء وضع قنية، تركيز الكولاجين ووقت الهضم، وسرعة تدفق المتوسطة، والتعامل مع الأنسجة بعد الهضم، وultracentrifugation التفاضلية الكلاسيكية.
يتم فصل الخلايا عن طريق الفصل من مكونات النسيج الضام بعد الهضم باستخدام الكولاجين النوع الرابع. تركيز الكولاجين المستخدمة لضخ يمكن أن تتراوح بين 0.1 إلى 5 ملغ / مل. يمكن أن يكون هناك تباين كبير من دفعة إلى دفعة في فعالية الكولاجين لهضم الأنسجة. تم اختبار تركيزات الكولاجين من 0.5 إلى 5 ملغ / مل، ولكن التركيز المستخدم لم يكن له تأثير كبير على العائد من المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها. استخدام تركيز أعلى من الكولاجين سيؤدي إلى تورم أسرع وتبييض الكبد. والهدف من ذلك هو الحصول على انفصال مرض عن الخلايا دون تلوث أو ضرر مفرط. التركيز الأمثل للكولاجيناز المستخدم في هذه العزلات هو 1-2 ملغ / مل perfused لمدة 7-8 دقائق بمعدل تدفق 8 مل / دقيقة. إجراء التسريب الذي هو طويل جدا زيادة خطر تدمير النسيج الضام رقيقة داخل الكبد، فضلا عن زيادة المخاطر التقنية مثل dislodgment إبرة من الوريد المدخل أو حبس الهواء مع الوريد.
والجانب الأكثر تحديا في هذا البروتوكول هو تعليب الوريد المدخل. هذا يمكن أن يكون تحديا لأداء, لا سيما في الفئران في نطاق حجم 18-25-ز. وقد وضعت تقنيات التسريب الكولاجينفي الأصل لاستخدامها في الفئران واعتمدت في وقت لاحق لاستخدامها في الفئران بعد العديد من التعديلات والتعديلات. التعليب باستخدام مجموعة جمع الدم 23G أسهل من وضع قسطرة في الأوعية الدموية ذات القطر الإنارة الصغيرة. ومن المستحسن إصلاح قنية باستخدام الموضوع مع عقدة سدادة لتجنب خلع وعقدة أيضا بمثابة علامة على موقع الوريد المدخل في حالة قنية يخرج من السفينة.
لتحليل المصب، من المهم للغاية أن يكون الحد الأدنى من التلوث من الخلايا. هناك العديد من الاعتبارات الهامة في التعامل مع الأنسجة بعد الهضم. أولا، يتم تغيير ملقط ومقص عندما يتم استخراج الكبد لتجنب تلوث الدم. ثانيا، من الأهمية بمكان أن تتم إزالة المرارة بعناية من الكبد لتجنب التمزق والتلوث غير المرغوب فيه من الصفراء. ثالثا، بمجرد إزالة الكبد من الماوس، يتم غسل الكبد بلطف شديد باستخدام PBS لإزالة أي دم. وينبغي إعطاء التقليل إلى أدنى حد من التلوث بالخلايا أولوية أعلى من تخفيض غلة المركبات الكهربائية التي يتم الحصول عليها.
Ultracentrifugation هو الأسلوب الأكثر استخداما لعزل وتنقيةالمركبات الكهربائية 8،9،10،11. هذا النهج سوف يزيل معظم الخلايا النكمعية مثل الخلايا الكبدية أو الخلايا الأقنية الصفراوية والخلايا غير parenchymal مثل خلايا Kupffer، والخلايا البطانية البطانية البطانية، والخلايا النجمية، بالإضافة إلى ذلك، فإن حطام الخلايا، وتجمعات الخلايا، والخلايا الميتة ستكون أيضا إزالة من قبل الطرد المركزي التفاضلية. ويمكن إجراء المزيد من تنقية وعزل مجموعات سكانية محددة عن طريق تحديد حجم الكروماتوغرافيا لاستبعاد هالاوغرافيا لإزالة أي مجاميع بروتين غير حويصلي أو بروتينات دهنية.
ويتمثل أحد قيود هذا البروتوكول في أنه قد لا يلتقط جميع حويصلات الأنسجة، بالنظر إلى إمكانية إزالة بعض الحويصلات في البيرفوسات. وإذا كانت هناك حاجة إلى تقييم عالمي، ينبغي النظر في جمع الحويصلات وعزلها داخل البيرفوسات. وهناك قيد آخر هو احتمال تلف الخلايا. لرصد التأثير المحتمل للموت المفرط للخلايا، يمكن رصد صلاحية الخلايا ودمجها ضمن معايير الجودة لعزل اتّهاب الأنسجة. في الختام، يصف هذا الإجراء سير عمل محسن باستخدام تقنية التسريب بخطوتين عبر الوريد المدخل متبوعاً بـ ultracentrifugation التفاضلي للحصول على مركبات EVs أنسجة الكبد من كبد الماوس بعائد مرتفع. هذه المركبات الكهربائية الأنسجة هي مناسبة للتحليلات المصب مثل توصيف التركيب الجزيئي الحيوي وغيرها من الدراسات التي تهدف إلى وصف أدوارها الفسيولوجية أو الفسيولوجية المرضية أو التطبيقات المحتملة كعلامات المرض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذه الدراسة بتمويل من المعهد الوطني للسرطان منحة CA-217833.
Materials
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| Curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Masking tape | Home supply store | ||
| Aluminum foil | Home supply store | ||
| Styrofoam pad | Home supply store | ||
| Absorbent Bench Underpad | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S Digital Miniflex Pump | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| Water bath | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| Blood collection sets | Becton Dickinson | 367292 | |
| Petri dish, clear lid 100×15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70mm Nylon Cell Strainers | Fisher scientific | 352350 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Cotton Tipped Applicators | Moore medical | 69622 | |
| 25mL Serological Pipet | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser | BioSurplus | 203-2751 | |
| O2 gas | |||
| Isoflurane | |||
| Levo Plus Motorized Pipette Filler | Scilogex | 74020002 | |
| Centrifuge 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50Fixed-Angle Rotor | Beckman | 363055 | |
| Nalgene Round-bottom tube | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly | Beckman | 355618 | |
| Reagents | |||
| HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Fisher scientific | 17104019 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |
References
- Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).
- Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. Extracellular vesicles in liver diseases. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).
- Kogure, T., Patel, T. Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture. Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).
- Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).
- Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).
- Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
