Очистка H3 и H4 Гистоны и количественная оценка ацетилированный гистона знаков в клетках и тканях мозга

Все мыши были размещены в контролем влажности и температуры, аккредитованных АААЛЖ животных фонда в Университете Майами Миллер школе медицины. Все эксперименты были одобрены в Университете Майами Миллер школа медицины институциональных животных ухода и использования Комитет (IACUC) и проведены согласно спецификации низ. 1. Подготовка образца экстракт Адэрентных клеток Плита клетки в 10 см блюда в соответствующей культуры СМИ (1 х 106 до 1 x 10-9 ячеек на блюдо для клеточных линий, таких как BV2, ГЭС-293 и SH-SY5Y, но ~ 1 x 1015 ячеек на блюдо для начальных ячеек, например первичного корковых нейронов). Заверить, что клетки, равномерно распределенных по всей поверхности пластины и позволяют клеткам расти за 48 ч до впадения ~ 100% (37 ° C, 5% CO2). После того, как клетки достигли желаемого confluency, нежно аспирационная культуры средств массовой информации и вымыть клетки 2 x с подогретую сыворотки свободных СМИ под капотом культуры ткани. Аспирационная сыворотки свободных СМИ от блюдо и добавьте 1 mL ледяной извлечения буфера (0,4 М серной кислоты, 1 мм KCl, 1 мм MgCl2, 50 Tris-HCl [рН 8,0] и 1 x коктейль ингибитор протеазы) к каждому блюду. Используйте пластиковые клетки скребок для собирать все клетки в буфере извлечения (соскоб) и передавать их на 1,5 мл, помечены трубка с 1000 мкл пипетки. Накапайте клетки вверх и вниз 3 x для облегчения гомогенизации. Закройте все трубы и немедленно положить их на льду. Ткани мозга Если используется замороженные ткани, ткани в prechilled 1,5 мл трубку и кратко оттепели на льду. Если используются свежие ткани, немедленно приступить к шаг 1.2.2.Примечание: Текущий протокол описывает процедуры с использованием замороженных мыши мозга и мыши префронтальной коры образцов. Однородный тканей, с использованием карманных Dounce гомогенизатор, используя соответствующее количество извлечения буфера и рекомендуемое количество штрихов (Таблица 1). Чтобы избежать чрезмерного хроматина измельчения, не превышают количество рекомендуемых штрихов. С помощью пипетки одноканальный 1000 мкл, передать prechilled 1,5 мл огневки. Закройте все трубы и немедленно положить их на льду. 2. подготовка сырой гистона экстракт Место 1,5 мл пробирки, содержащие клетки или ткани, приостановлено в буфере добычи на вращающейся платформе и повернуть на 15 об/мин при 4 ° C, чтобы позволить добычи нефти гистонами.Примечание: Время добыча может различаться для разных клеток и тканей типа и должны быть оптимизированы для каждой процедуры. Текущий протокол представляет результаты, полученные после 15 мин, 2 h и 24 h добычи (Рисунок 2, рис. 3, рис 4и рис. 5). Prechill microcentrifuge до 4 ° C. После того, как прошло время желаемого извлечения, центрифуга трубы на максимальной скорости на 10 мин при 4 ° C. Передача супернатанта, включая сырой гистонов к новой, prechilled 1,5 мл. Выбросите гранулы. Хранить супернатант в-80 ° C (добыча может быть остановлен на этом шаге см «Stop шаг» на рис. 1) или сразу перейти к следующему шагу. Нейтрализовать сырой гистонами объемом 1/4 5 x нейтрализации буфера (например, 250 мкл 5 x нейтрализации буфера до 1 мл сырой гистонами). Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз 6 x. Проверьте рН в смеси с рН полоски. Корректировать, добавив больше нейтрализации буфера для достижения рН 7. Оценивать наличие гистона и nonhistone белков в сырой гистона извлечь следующим образом (рис. 2). 37,5 мкл пример до 12,5 мкл 4 x буфер образца (Лэмли) и денатурировать 10 мин на 99 ° C. Загрузить образец на геля SDS-PAGE и Побегите гель для 1 h 100 V. Пятно гель на ночь с решением Окрашивание Кумасси синим R-250 и Отмойте в течение трех последовательных моек (1 ч/мыть) раствором минигелей Кумасси синим R-250.Примечание: Сырой гистонов (рис. 2) можно сравнить с eluted и очищенный гистонов (т.е., столбец ввода [Рисунок 5A]). 3. Очистка Core гистонами Спиновые столбца уравновешивания Добавьте 500 мкл буфера уравновешивания каждый спин столбец используется. Не прикасайтесь столбца мембраны. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Отказаться от потока через. Повторите 1 x. Очистка гистона Добавьте 500 мкл пример интерес из шага 2.6 в столбце. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Соберите потока через. Повторите предыдущий шаг столько раз, сколько необходимо загрузить весь образец на столбец. Не переполняйте столбце спина. Объединить потока через от каждого шага центрифугирования для анализа эффективности связывание столбцов (рис. 3). Выполните шаг 2.7 для анализа потока через колонки. Колонка мыть 500 мкл буфера мытья, для каждого столбца. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Соберите потока через стирка (стирать #1). Повторите шаг 3.3.1 для в общей сложности три автомойки. Соберите моет потока через #2 и #3. Не пула последовательных столбцов потока через смывки. Для дальнейшей оценки эффективности гистон привязка столбца, проанализируйте три колонки моет, выполнив шаг 2.7 (рис. 4). Элюирующий гистона Перевести столбец в новой маркировкой 1,5 мл трубки. Добавьте 50 мкл гистона Элюирующий буфер. Центрифуга при температуре 4 ° C на 3 мин на 800 x g. Сохранение потока через содержащих гистоны. Для дополнительного элюции повторите шаг 3.4.2. Не следует сочетать первого и второго потока через элюаты, как они отличаются в количестве гистона и чистоты. 4. осадки основных гистонами Добавление очищенный гистонами до конечной концентрации 4% хлорной кислоты (PCA) PCA (например, 3 мкл 70% PCA до 50 мкл очищенный гистонами от шага 3.4.2. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости от стенки трубки. Смешайте закупорить вверх и вниз 6 x. Трубы в стойку и инкубировать в течение 24 ч при 4 ° C. На следующий день, prechill microcentrifuge до 4 ° C и Центрифугуйте образцы 75 минут на максимальной скорости при 4 ° C. После центрифугирования, небольшой белые гранулы, содержащие осажденный гистонами будет видна в нижней части трубки. Сделать не вихревой образца. Тщательно удалить супернатант и, не нарушая гранулы, добавить 500 мкл ледяной 4% PCA образца. Центрифуга на 4 ° C на 10 мин на максимальной скорости. Тщательно удалить супернатант. Повторите шаг 4.7 2 x. Не нарушая гранулы, 500 мкл ледяной ацетона. Центрифуга на 4 ° C на 10 мин на максимальной скорости. Тщательно удалить супернатант. Повторите шаг 4.9 2 x. Тщательно удалить супернатант, оставить трубы контаминированных и позволить образца сушиться на льду на 30 мин проверить, если все остаточные ацетон испарилась. Оставьте трубы контаминированных и позволяют образца высохнуть при комнатной температуре (RT) 5 мин. Ресуспензируйте гранулы в 30 мкл стерильной воды. Сделать не накапайте вверх и вниз. Флик трубку осторожно с пальцем. Cap все трубы и позволяют гистонами воссоздать на льду на 30-50 минут, в зависимости от размера гранул. Проверьте, если высокомобильна гранулы. Cap все трубы и позволяют гранулы для дальнейшего Ресуспензируйте на RT на 5 мин.Примечание: Это решение (первый и второй элюции от шага 3.4.3) состоит из очищенной и обессоленной Гистоны и могут быть использованы для дальнейшего анализа ацетилирования количественной и гистонов. 5. Количественная оценка Eluted гистоны Используйте спектрофотометр согласно производителя протокол для количественного определения общего гистоны, полученные после окончательного элюции в шаге 4.15. Измерение оптической плотности на 230 Нм. Запись A260/A280 соотношение свидетельствует пример загрязнения с нуклеиновой кислоты. Используйте следующую формулу для расчета концентрации гистонов (x):Здесь ОД является оптическая плотность измеряется в A230 Нм. Гистона концентрации ~1.5 мг/мл считается средняя доходность для клеточных линий, а концентрация гистона ~5.0 мг/мл является средняя урожайность на 30 мг ткани. 6. Западный анализ помаркой Отрегулируйте очищенный и eluted гистона от шаг 4.15 до ~ 10 мкг белка гистонов/образца. Добавьте соответствующий объем воды и 4 x Laemmli буфер образца для настройки загрузки томов. Денатурируйте образцы для 10 мин на 99 ° C. Охладьте их на льду. Центрифуги для 3 s для сбора всех остатков жидкости и конденсации от стенки трубки. Загрузить образцы на геля SDS-PAGE и Побегите гель для 1 h 100 V. Для визуализации всего гистоновых белков, пятно гель на ночь с решением Окрашивание Кумасси синим R-250 и Отмойте в течение трех последовательных моек (1 ч/мыть) раствором минигелей Кумасси синим R-250.Примечание: Первый элюции гистоны содержит высококачественные гистонов (Рисунок 5A), а второй элюции низкой не уровням гистонов (Рисунок 5B). Чтобы подсчитать гистона PTMs, используйте систему передачи (см. Таблицу материалы) для передачи белка гистонов от геля SDS-PAGE (шаг 6.4) на PVDF мембрану. Чтобы собрать передачи сэндвич, Откройте кассетный системы передачи и место PVDF мембрану стека (помечены как дно +) в нижней части кассеты с мембраной, вверх. Roll мембраны нежно с роликом пятно удалить воздух из стека и мембраны. Положите гель на вершине мембраны, ролл аккуратно с роликом пятно удалить воздух из мембраны и лари и место Топ стека на геле. Рулон осторожно снова поместите крышку кассеты поверх сэндвич, нажмите вниз твердо и поверните по часовой стрелке для блокировки Ноб. Вставьте кассету в слот системы передачи. На экране аппарата выберите Протокол Turbo. Используйте протокол 3 мин для одной мини-гель или 7 мин протокол для более чем двух мини-гели. Пятно мембраны с Пуансо пятно на 5 мин и визуализировать всего гистоны. Мыть их в 1 x трис амортизированное saline (TBS) с 0.1% 20 анимации для 2 h и блокировать их в 5% молока за 1 ч. инкубировать с первичных и вторичных антител (на ночь при 4 ° C или 1 ч на RT, соответственно) или согласно ранее оптимизированный протокол.Примечание: В текущей протокол, антител против ацетилированный гистонов H4K12 (Рисунок 6 и рис. 7) и H3K27 (рис. 8) были использованы.