H3 ・ H4 ヒストン蛋白質細胞および脳組織におけるアセチル化ヒストンの定量化の浄化

すべてのマウスは、湿度と温度の制御 AAALAC 認定動物施設でマイアミ大学ミラー医学で収容されました。すべての実験はマイアミ ミラー学校の医学機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認され、NIH.の仕様に従って実施 1. サンプル抽出の準備 付着性のセル 適切な培養液 (1 x 106 〜 一次皮質ニューロンなど、初代培養細胞用ディッシュ 1015セル × 1、SH SY5Y、HEK 293、BV2 などの細胞ラインに皿あたり 1 x 10 の9セル) で 10 cm 料理のプレート細胞。セル板の表面全体に均等に分散でき、48 h (37 ° C、5% CO2) ~ 100% の合流点に到達するために成長する細胞を保証します。 セルが目的の confluency に達したら、優しく培地を吸引し、洗浄セル 2 ティッシュ文化フードの下で prewarmed 血清無料メディアで x。 お皿から血清フリー メディアを吸引、1 mL の氷冷抽出バッファーを追加 (0.4 M 硫酸、1 mM KCl、1 ミリメートル MgCl2、50 ミリメートル トリス-HCl [pH 8.0] とプロテアーゼ阻害剤のカクテル 1) それぞれの皿に。 プラスチック電池スクレーパーを使用して、(こする) によって抽出バッファー内のすべてのセルを収集し、ラベル 1,000 μ L ピペット管 1.5 mL に転送します。セルを上下に均質化を容易にする 3 x ピペットで移しなさい。 すべてのチューブを閉じるし、すぐに氷の上にそれらを置きます。 脳組織 凍結するティッシュを使用している場合 prechilled 1.5 mL チューブにティッシュを置き、簡単に氷の解凍。新鮮な組織を使用している場合は、1.2.2 をステップにすぐに進みます。注: 現在のプロトコルは、冷凍マウスの脳およびマウス前頭前野のサンプルを使用して手順を説明します。 抽出バッファーの適切な量と推奨される (表 1) のストロークの数を使用してハンドヘルド Dounce ホモジナイザーを使用して組織をホモジナイズしてください。過剰なクロマチンの細断処理を避けるため、推奨されるストロークの数を超えないようにします。 単一チャネル 1,000 μ L ピペットを使用して、prechilled 1.5 mL チューブに磨砕液を転送します。すべてのチューブを閉じるし、すぐに氷の上にそれらを置きます。 2. 原油ヒストン抽出物の準備 細胞または組織抽出バッファー回転プラットフォーム上で中断を含む 1.5 mL チューブを置き、原油のヒストンの抽出を許可する 4 ° C で 15 rpm で回転します。注: 抽出時間別の細胞と組織型の異なる場合があります、各プロシージャ用に最適化する必要があります。現在のプロトコルは次の 15 分、2 h、24 h の抽出 (図 2図 3図 4、および図 5) 得られた結果を提示します。 4 ° C に遠心を prechill します。目的の抽出後時間が経過、4 ° C で 10 分間最大速度でチューブを遠心分離 新しい prechilled 1.5 mL チューブに原油のヒストンを含む上清を転送します。ペレットを破棄します。 -80 ° C で上清を保存 (この段階で抽出を停止ことができます図 1の「停止手順」を参照してください) またはすぐ次ステップに進みます。 中和バッファー x 5 の 1/4 量を原油のヒストンを中和する (例えば、原油ヒストンの 1 mL に中和バッファー x 5 の 250 μ L を追加)。6 x 上下ピペッティングでよく混ぜます。 PH のストリップとの混合物の pH をチェックします。調整 7 の pH に到達するためのより多くの中和バッファーを追加しています。 ヒストンの存在を評価し、原油のヒストンのヒストン蛋白質抽出 (図 2) では次のようにします。 (塩化物イオン) サンプル バッファー x 4 12.5 μ に 37.5 μ L のサンプルを追加し、99 ° c. で 10 分の変性 SDS ページのゲルにサンプルをロードし、100 V で 1 時間のためのゲルを実行します。 Coomassie ブリリアント ブルー R-250 染色液で一晩ゲルを染色し、3 連続洗浄 (1 h/ウォッシュ) 中 Coomassie ブリリアント ブルー R-250 脱染め色液をすすぐ。注: 原油ヒストン (図 2) は、溶出、浄化されたヒストン (すなわち列の入力 [図 5 a]) と比較できます。 3. 精製コアヒストンの 回転カラムの平衡化 使用されている各スピン列に平衡バッファーの 500 μ L を追加します。列膜を触れないでください。 4 ° C で 800 x gで 3 分間遠心します。流れを破棄します。1 x を繰り返します。 ヒストン浄化 列にステップ 2.6 から目的の標本の 500 μ L を追加します。4 ° C で 800 x gで 3 分間遠心します。流れを収集します。 列にサンプル全体を読み込むに必要な回数だけこの手順を繰り返します。スピン列を入れすぎないではないです。 列バインディング効率 (図 3) を分析する各遠心分離のステップから流れを組み合わせ。 2.7 列の流れを分析するための手順に従ってください。 カラムの洗浄 洗浄バッファーの 500 μ L を各列に追加します。4 ° C で 800 x gで 3 分間遠心します。流水で洗い (#1) を収集します。 3.3.1 ステップ 3 洗浄の合計に対して繰り返します。#2、3 位の流水洗浄を収集します。連続列の流水洗浄をプールしません。 さらに列のヒストン結合効率を評価、3 つのカラムの洗浄手順 2.7 (図 4) を分析します。 ヒストン溶出 新しいラベル 1.5 mL チューブに列を転送します。 ヒストン溶出バッファーの 50 μ L を追加します。4 ° C で 800 x gで 3 分間遠心します。流れを含んでいるヒストン蛋白質を保存します。 追加の溶出の 3.4.2 のステップを繰り返します。ヒストン量と純度が異なります、最初と 2 番目の流れを通して波を結合しません。 4. コアヒストンの沈殿物 4% の最終濃度に精製されたヒストンに過塩素酸 (PCA) を追加 PCA (例えば70% の 3 μ L を追加手順 3.4.2 から精製したヒストンを 50 μ l 添加する PCA。 3 遠心分離機管の壁からすべての残留液体を収集する s。6 x 上下ピペッティングで混ぜます。 ラックにチューブを置き、4 ° C で 24 時間インキュベート 次の日、prechill 4 ° C に遠心機と遠心分離機の 4 ° C で最大速度で 75 分のサンプル 遠心分離が完了すると、沈殿したヒストンを含む小さな白いペレットはチューブの下部に表示されます。ボルテックスにかけないでくださいサンプルです。 慎重に、上清を吸引し、ペレットを乱すことがなく追加冷えた 4% の 500 μ L のサンプルに PCA。 4 ° c の最高速度で 10 分間遠心します。慎重に上清を吸引します。 手順を繰り返します 2 4.7 x。 ペレットを妨げないで、氷冷アセトン 500 μ L を追加します。4 ° c の最高速度で 10 分間遠心します。慎重に上清を吸引します。 手順を繰り返します 4.9 2 x。 慎重に、上清を吸引、脱帽、チューブのまま、すべての残留アセトンが蒸発した場合 30 分チェックのため氷の上乾燥するサンプルを許可します。 真空管は脱帽、室温 (RT) で乾燥するサンプルは、5 分を残す。 30 μ L の滅菌水にペレットを再懸濁します。ないピペットを上下に行います。指で軽くはじきます。 すべてのチューブをキャップし、ペレットのサイズに応じて、30-50 分間氷の上を再構成するヒストンを許可します。ペレットは再停止されるかどうかチェックしてください。 すべてのチューブをキャップし、さらに 5 分間室温で再懸濁しますにペレットを許可します。注: このソリューション (ステップ 3.4.3 から最初と 2 番目の溶出) 精製、脱塩のヒストンを構成してさらに定量化とヒストンのアセチル化分析に使用可能性があります。 5. 溶出ヒストン蛋白質の定量 4.15 の手順で最終的な溶出後に得られた合計ヒストン蛋白質を定量化するのに製造元のプロトコルに従って分光光度計を使用します。230 で吸光度を測定 nm。A260/A280 比核酸のサンプルの汚染を示すものを記録します。 ヒストンの濃度 (x) を計算する次の数式を使用します。ここでは、OD は A230 nm で測定した光の密度です。 ~1.5 mg/mL のヒストン濃度は ~5.0 mg/mL のヒストン濃度は組織の 30 ミリグラムの平均収量と見なされます細胞株の平均利回りを考慮されます。 6. 西部のしみの分析 ヒストン蛋白質/サンプルのステップ 4.15 〜 10 μ g から精製され、溶出したヒストンを調整します。 読み込みのボリュームを調整する 4 x Laemmli サンプル バッファーや水の適切な量を追加します。 99 ° c. で 10 分のサンプルを変化させなさい。クール氷に。3 遠心分離機管の壁からすべての残留液と結露を収集する s。 SDS ページのゲルにサンプルをロードし、100 V で 1 h のためのゲルを実行します。 合計ヒストン蛋白質を視覚化し、Coomassie ブリリアント ブルー R-250 染色液で一晩ゲルを染色中 3 回すすぐ連続洗浄 (1 h/ウォッシュ) Coomassie ブリリアント ブルー R-250 脱染め色液を。注: 2 番目の溶出がヒストン (図 5 b) のないレベルに低含まれていますが、ヒストン蛋白質の最初の溶出に高品質ヒストン (図 5 a) が含まれます。 ヒストン Ptm を定量化する転送システムを使用 (材料の表を参照) PVDF 膜に SDS ページのゲル (ステップ 6.4) からヒストン蛋白質を転送します。 転送サンドイッチを組み立て、転送システム カセットを開き、上向き膜をカセットの底に (下+ ラベル) PVDF 膜スタックを配置します。スタックの間から空気を削除するしみローラーで軽く膜と膜をロールバックします。 膜の上にゲルを置く、ロール膜の間の空気を抜くためのしみローラーで軽くゲル、ゲル、ゲル上のスタックに配置。もう一度挟みとカセット カバーをサンドイッチ上に置き、しっかりと押し下げ、ノブをロックを時計回りに回します。 転送システム スロットにカセットを挿入します。装置の画面では、ターボのプロトコルを選択します。単一ミニ ゲルまたは 2 つ以上のミニ ゲル 7 分プロトコル 3 分プロトコルを使用します。 5 分 Ponceau S 染色で膜を染色し、合計ヒストン蛋白質を可視化します。 トリス緩衝生理食塩水 (TBS) 0.1% で × 1 で洗って 2 h およびブロック 1 h. 加温一次および二次抗体とのミルクの 5% のそれらのトゥイーン 20 (4 ° C または常温では、1 h でそれぞれ一晩) または前に最適化されたプロトコルに従って。注: 現在のプロトコル、抗体アセチル化されたヒストン H4K12 (図 6および図 7) H3K27 で (図 8) 使用されました。