تنقية H3 و H4 هستون بروتينات والتحديد الكمي لعلامات هيستون أسيتيلاتيد في خلايا وأنسجة المخ
Summary
والغرض من هذه المقالة توفير دليل شامل ومنهجي لفعالية تنقية histones H3 و H4 والتحديد الكمي لبقايا هيستون أسيتيلاتيد.
Abstract
في جميع الكائنات الحية حقيقية النواة، الكروماتين، القالب الفسيولوجية للمعلومات الوراثية كل شيء، أمر أساسي للوراثة. الكروماتين يخضع لمجموعة تعديلات بوسترانسلاشونال متنوعة (بتمس) أن معظمها تحدث في تيرميني الأمينية البروتينات هستون (أي، ذيل هيستون) وتنظيم الوصول والدولة الوظيفية من الحمض النووي الأساسية. هيستون ذيول تمتد من جوهر نوكليوسومي وتخضع لإضافة مجموعات أسيتيل أسيتيلترانسفيراسيس هستون (القبعات) وإزالة مجموعات أسيتيل هيستون ديسيتيلاسيس (هداكس) أثناء النمو الخلوي والتمايز. تحديد أنماط acetylation محددة على بقايا يسين (K) في ذيول هستون التوازن ديناميكي بين الكروماتين ترانسكريبتيونالي النشطة أو مكبوتة ترانسكريبتيونالي بالتأثير على الجمعية هيستون الأساسية (1) و (2) توظيف التآزر أو معادية من البروتينات المرتبطة الكروماتين إلى موقع النسخ. الآلية التنظيمية الأساسية للطبيعة المعقدة للذيل هيستون بتمس يؤثر معظم الكروماتين templated العمليات والنتائج في التغييرات في نضوج الخلية، والتمايز في التنمية العادية والمرضية على حد سواء. والهدف من هذا التقرير تزويد المبتدئين بطريقة فعالة لتنقية البروتينات هستون الأساسية من خلايا وأنسجة المخ وقياس موثوق بها علامات أسيتيليشن على هيستونيس H3 و H4.
Introduction
التخلق مصطلح يشير إلى التغييرات الموروثة في نشاط الجينات التي تحدث بصورة مستقلة عن التغييرات في تسلسل الحمض النووي1،2. النسخ الجيني والقمع مصممون (1) إمكانية الحصول على الحمض النووي الكروموسومات ملفوفة حول أوكتامير البروتينات هستون الأساسية (اثنان نسخ كل من H2A H2B، H3 و H4) ومن (2) توافر عوامل النسخ وسقالة البروتينات وعين للمروج محددة المواقع3،4. ينظم النسخ الجيني بوساطة إنزيم تعديلات محددة المواقع المروج الحمض النووي وبتمس هيستون ذيول5،،من67. ن-تيرميني من هستون H3 و H4 بين تسلسلات أشد المصانة المعروفة في الكائنات الحية حقيقية النواة3، وتم توثيق هذه التعديلات بوستترانسلاشونال على نطاق واسع تلعب دوراً محوريا في تحديد هيكل الكروماتين و وظيفة8،9. بتمس في ذيول هستون (أي، أسيتيليشن، مثلايشن، الفسفرة وأوبيكويتينيشن) تغيير إمكانات التفاعل من الذيول والتأثير في هيكلية الدولة وقابلة للطي للألياف الكروماتين، ومن ثم، تنظيم وصول الحمض النووي وتجهيز4،10،،من1112. إضافة إلى مجموعات أسيتيل وإزالتها من بقايا ك في ذيول هستون بمجموعة محددة تتفاعل هيستون جينية الإنزيمات، هما القبعات وهداكس، على التوالي13. على سبيل المثال، أسيتيليشن هيستون H4 في يسين 12 (H4K12ac) قد ثبت سابقا لتفعيل نسخ الجينات المتصلة ب اكتساب وترسيخ الذاكرة14. بالإضافة إلى ذلك، عدة أسطر من الأدلة تشير إلى أن سيطرة جينية بوساطة إنزيم النسخ الجيني أحد جوانب الهامة لصحة الخلوية النمو والتمايز6،15. وقد ثبت التناوب في تنظيم التعبير الجيني، بتعديلات جينية في الحمض النووي أو بطفرة من الإنزيمات جينية أنفسهم، جينية dysregulated في الأمراض التي تصيب الإنسان حيث تغير في نشاط جينات خاصة علامة مميزة 16،علم الأمراض (مثلاً، السرطان)6،17. وهكذا، تقييم التغييرات في هيستون الأساسية بتمس تبرز كهدف ذات القيمة العالية للتدخلات العلاجية المحتملة. بيد تحديد الوفرة، شركاء المتفاعلة، والأدوار المحددة بتمس histones قد ثبت تحديا18.
ويرد في التقرير الحالي، واستراتيجية محسنة والإنتاجية المتوسطة لتنقية histones الأساسية من خلايا وأنسجة المخ في جزء واحد، وبروتوكول كامل للتحديد الكمي ل histones H3 و H4 بتمس. ملاحظة، على الرغم من أن تنشر حاليا على أساس حمض هيستون المستندة إلى جسم الكشف عن استراتيجيات وتقنيات تنقية قد اعتمدت على نطاق واسع لتوصيف هستون، أنها تفتقر إلى التفاصيل الوصفية فيما يتعلق بالخطوات الحاسمة لهذا الإجراء، وهكذا التي تعرقل استخراج هيستون سريعة وقابلة للتكرار، والتقدير الكمي. على سبيل المثال، استخراج تجهيز الخلية وخزعات الأنسجة يتطلب تكنولوجيات وأدوات مختلفة لاستخراج ناجحة. وعلاوة على ذلك، يوضح البروتوكول الأمثل في المخطوطة الحالية اتباع نهج عملي والإنتاجية المتوسطة. يتم استخراج histones الأساسية كشريحة واحدة ونقية، التي تمكن موثوقة المتلقين للمعلومات بوساطة جسم PTM الكشف دون أي تدخل من الشوائب. وعلاوة على ذلك، تم في المخطوطة الحالية، التحايل التحديات فيما يتعلق بكشف هستون بسبب وزنها الجزيئي صغير. عادة، يعيق انعدام التوافق بين تنقية والتقدير الكمي، وبروتوكولات التفريد جل العلماء من الحصول على نتائج قابلة للتكرار وقاطعة. ويرد هنا، سير العمل أمثل لتنقية histones الأساسية من الخلايا والأنسجة وإعدادهم لتحليلات PTM المصب عبر لطخة غربية.
ويتيح البروتوكول الحالي تنقية البروتينات هستون الأساسية مع الحفاظ على تلك التعديلات بوستترانسلاشونال الأصلي (أي، أسيتيليشن، مثلايشن والفسفره). ويصور الشكل 1 الجدول الزمني للبروتوكول تنقية هيستون.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفي العمل الحالي، أثبتنا أسلوب أمثل لتنقية البروتينات هستون الأساسية وتحديدها كمياً هيستون H3 و H4 بتمس (مثلاً، أسيتيليشن). البروتوكول المقدم هو الأمثل سير عمل شامل الذي يتضمن إجراءات تتعلق بالخلايا وإعداد أنسجة المخ، والخام شطف تنقية هستون، وهطول الأمطار هيستون مفصلة، والتقدير الكمي، التي تليها التفريد هيستون والكمي PTM هيستون قوية. كمية كبيرة من التفاصيل المقدمة هنا يسمح لجيل قابل للنسخ المتماثل من بيانات عالية الجودة، على الرغم من الحاجة إلى التلاعب مطولة من عينات هيستون.
تتطلب العديد من البروتوكولات المنشورة حاليا الاستخدام [هبلك] لعزل الكسور نقية histones H3 و H419. على الرغم من أن [هبلك] تقنية قوية، التعقيد ومنخفضة الإنتاجية ردع معظم علماء البيولوجيا الجزيئية ونونيكسبيرتس من الاستخدام المتكرر. وفي الواقع، [هبلك] لا تتوفر للعديد من مختبرات، ومطلوب من الأفراد ذوي المهارات العالية تشغيل الأجهزة. [هبلك] في كثير من الأحيان مضيعة للوقت ومكلفة، ويحتمل أن تكون خطرة. قدم هنا هو استراتيجية غير مكلفة، ومتوسط الإنتاجية لتحقيق نتائج ذات نوعية مماثلة الذي يتجاوز [هبلك]. الاستراتيجية التي تم الإبلاغ عنها أيضا أكثر عملية ومناسبة للاستخدام في أي مختبر كما أنه يستخدم نهجاً عمود دوران بسيط التي لا تتطلب مهارات عملية صك المتخصصة. بالإضافة إلى ذلك، يتم استخراج هيستون H3/H4 تيترامير كواحد، نقية، وكسر وفيرة، مما يتيح إجراء تقييم كمي موثوق بتمس يتم الحفاظ عليها في كل من البروتينات.
بتمس حساسة للغاية للتغييرات في الأكسدة، والتغيرات في درجة الحموضة20،21. وهكذا، على النقيض من الأساليب المنشورة سابقا18، نحن تقرير استراتيجية فعالة الشطف خلايا خالية من المصل وسائل الإعلام لضمان اضطرابات ايضية الحد أدنى من الخلايا وتجنب تدخل بتمس الأصلية مع مكونات المصل. البروتوكول الحالي لا يتجاوز عزلة نويات التقليدية بل أيضا يوفر الأوقات المثلى لتحلل الخلية والإجراء تجانس النسيج الدقيق الذي يسمح للحفاظ على المغلف النووية مع تجنب التراكم النووي. على الرغم من أن يمكن التلاعب بها وقت استخراج استناداً إلى العدد من الخلايا، نوع الخلية المستخدمة، وحجم الأنسجة، إلخ، تحلل الموسعة غير مرغوب فيه كما أنها قد تؤدي إلى تحلل أنوية والإفراج عن الحمض النووي، مما يجعل من الصعب على التعامل مع العينة. الأهم من ذلك، توجد نقاط تفتيش متعددة ضمن البروتوكول للتحقق من الصحة لتنقية هيستون الناجحة (مثلاً، خطوات 2.7 و 3.2.3). وتسهل هذه الاستراتيجية أيضا استكشاف الأخطاء وإصلاحها طوال الإجراءات المطولة.
ميزة أخرى هامة وفريدة من نوعها للبروتوكول المقدم هو توافقه الكامل مع أدوات تحليل لطخة غربية المصب والبعض الآخر إذا رغب في ذلك. ويتم الكشف عنها في ~ 15 كاتشين13،،من2223 البروتينات هستون، وبالمثل لغيرها من البروتينات صغيرة الوزن الجزيئي، وقد أثبتت تحديا للكشف عن طريق التقنيات القياسية immunoblotting. يسمح استخدام نظام نقل ذات الأداء العالي والفائق في تركيبة مع الجل البروتين القرار الأمثل للحفاظ على النشاط في غياب الحزب الديمقراطي الصربي ونقل عالية الكفاءة وتأكيد البروتين الأصلي (في غياب الحزب الديمقراطي الصربي) من البروتينات هستون الوزن الجزيئي المنخفض، وبالتالي ضمان إجراء تقييم كمي PTM هيستون موثوق بها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يعربون عن امتنانهم لبرنامج البحوث بفلوريدا وزارة الصحة اد واثيل مور الزهايمر (منح 6AZ08 و 7AZ26)، والمعاهد الوطنية للصحة-نياا (منحة 5R01AA023781-03)، وجمعية القلب الأمريكية (منحة 17PRE33660831).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | ThermoFiser Scientific | 05-408-129 | or equivalent from other sources |
| Sterile water | Gibco | 15-230-204 | or equivalent from other sources |
| 70% perchloric acid | Sigma Aldrich | 311421 | or equivalent from other sources |
| 100% acetone | Sigma Aldrich | 270725 | or equivalent from other sources |
| pH-indicator strips, non-bleeding | Milliipore Sigma | 1095310001 | |
| 4x SDS sample buffer | BIO-RAD | 161-0747 | |
| Benchtop rotor | Cole-Parmer | UX-04397-34 | or equivalent from other sources |
| 1.5 mL tube rack | ThermoFiser Scientific | 05-541 | or equivalent from other sources |
| Histone purification mini kit | Active Motif | 40026 | spin columns included in the kit |
| Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFiser Scientific | 78430 | or equivalent from other sources |
| Nanodrop instrument | ThermoFiser Scientific | ND-2000 | |
| Tissue culture dishes | VWR | 10062-880 | required for histone extraction from cultured cells |
| Tissue culute media | varies based on cell line used | varies based on cell line used | required for histone extraction from cultured cells |
| Low-serum media | ThermoFiser Scientific | 51985091 | required for histone extraction from cultured cells |
| Plastic cell scraper | Falcon | 353086 | required for histone extraction from cultured cells |
| SDS-PAGE gradient gel | BIO-RAD | 456-9035 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Staining Solution | BIO-RAD | 1610436 | required for histone extraction from cultured cells |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 Destaining Solution | BIO-RAD | 1610438 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BIO-RAD | 1704156 | required for histone extraction from cultured cells |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | RIO-RAD | 1704150 | required for histone extraction from cultured cells |
| Ponceau S stain | CellSignalling | 59803S | required for histone extraction from cultured cells |
| Dounce homogenizer (size/cap sc 7mL) with a small size clearance | Kimble Chase | 885302-0007 | required for histone extraction from tissues |
| 100% bleach | Clorox | 68973 | required for histone extraction from tissues |
| H4K12ac antibody | Active Motif | 39166 | required for PTMs quantification via WB |
| H3K27ac antibody | Active Motif | 39134 | required for PTMs quantification via WB |
References
- Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory?. Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
- DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
- Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
- Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
- Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
- Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
- Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer’s disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160 (2014).
- Roh, T. -. Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
- Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
- Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
- Volmar, C. -. H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
- Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer’s Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
- Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
- Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
- Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617 (2016).
- Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59 (2016).
- Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029 (2014).
- Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
- Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , (2018).
- Volmar, C. -. H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer’s Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470 (2015).
- Volmar, C. -. H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).
