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Genetics

qKAT : quantitatif semi-Automated typage des cellules tueuses-gènes de récepteurs immunoglobuline-like

Published: March 06, 2019
doi:
10.3791/58646
, , , , ,
1Department of Pathology,University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience,University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology,University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research,University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution,University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences,University of Cambridge

Summary

Quantitative des cellules tueuses récepteur immunoglobuline-like (KIR) saisie semi-automatique (qKAT) est une méthode simple, haut-débit et rentable pour copier le numéros gènes de type KIR pour leur application dans les études d’association de la population et de la maladie.

Abstract

Récepteurs de cellules tueuses immunoglobuline-like (RIC) sont un ensemble de récepteurs immunitaires inhibitrices et activation, tueuses naturelles (NK) et de lymphocytes T, codées par un cluster polymorphe des gènes sur le chromosome 19. Leurs ligands mieux caractérisés sont les molécules d’antigen (HLA) de leucocytes humains qui sont codés dans le locus (MHC) complexe majeur d’histocompatibilité sur le chromosome 6. Il y a des preuves substantielles qu’ils jouent un rôle important dans l’immunité, la reproduction et la transplantation, rend crucial d’avoir des techniques qui peuvent précisément génotype eux. Cependant, haute-homologie, aussi bien qu’allélique et variation numéro de copie, rendent difficile de génotype et efficacement les méthodes de conception qui peuvent avec précision tous les gènes KIR . Les méthodes traditionnelles sont généralement limitées dans la résolution des données obtenues, débit, la rentabilité et le temps nécessaire à la mise en place et d’exploiter les expériences. Les auteurs décrivent une méthode appelée quantitative KIR saisie semi-automatique (qKAT), qui est une méthode de PCR multiplex Real-Time polymerase haut débit qui permet de déterminer le nombre de copies du gène pour tous les gènes dans le locus KIR . qKAT est une méthode simple de haut débit qui peut fournir des données à haute résolution KIR copie numéros, qui permet plus d’en déduire les variations dans les haplotypes structurellement polymorphes qui englobent les. Ces données de nombre et haplotype de copie peuvent être bénéfiques pour les études sur les associations de maladies à grande échelle, la génétique des populations, ainsi que les enquêtes sur l’expression et les interactions fonctionnelles entre KIR et HLA.

Introduction

Chez l’homme, le tueur récepteur immunoglobuline-like(KIR) locus est localisé sur le bras long du chromosome 19 dans le complexe de récepteur de leucocyte (LRC). Ce locus est d’environ 150 Ko de long et comprend 15 KIR gènes disposées tête à queue. Les locus KIR qui sont actuellement connues sont KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3, et deux pseudogènes, KIR2DP1 et KIR3DP1. KIR gènes codent pour deux dimensions (2D) et tridimensionnels (3D) domaine d’immunoglobuline-like récepteurs avec short (S ; activation) ou long (L ; inhibitrice) pastilles cytoplasmique, qui sont exprimés par les cellules tueuses naturelles (NK) et de sous-ensembles de T cellules. Copie variation numéro exposé dans les formes de locus KIR différents haplotypes avec gène variable contenu1. Recombinaison homologue non-alléliques (NAHR), facilitée par un arrangement de gène de tête-à-queue étroite et haute-homologie, est le mécanisme proposé d’être responsable pour la variabilité haplotypique. Plus de 100 différents haplotypes ont été signalés dans les populations dans le monde1,2,3,4. Tous ces haplotypes pourrait être divisées en deux grands groupes : les haplotypes A et B. L’haplotype A contient 7 gènes KIR : KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1et KIR3DL2, qui sont des gènes inhibiteurs de KIR et l’activation KIR gène KIR2DS4. Cependant, jusqu’à 70 % de personnes d’origine européenne qui sont homozygotes pour KIR haplotype A exclusivement effectuer une forme non fonctionnelle « suppression » de KIR2DS45,6. Toutes les autres combinaisons de gènes KIR forment d’haplotypes du groupe B, dont au moins un des gènes spécifiques KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2, et KIR2DL5et comprennent généralement deux ou plusieurs gènes KIR activant.

Molécules HLA classe I ont été identifiés comme les ligands pour certains récepteurs inhibiteurs (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3et KIR3DL1), activant les récepteurs (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5et KIR3DS1), et pour KIR2DL4, qui est un unique KIR qui contient un long cytoplasmique queues comme autres récepteurs inhibiteurs de KIR, mais dispose également d’un résidu chargé positivement près le domaine extracellulaire qui est un commun fonction d’autres récepteurs KIR activant. La combinaison des variantes dans les gènes KIR et les gènes HLA influence interaction ligand du récepteur cette réactivité de cellules NK potentielle de formes au niveau individuel7,8. Preuves provenant d’études de liaison génétique a indiqué que le KIR joue un rôle dans la résistance virale (par exemple., le virus d’immunodéficience humaine [VIH]9 et l’hépatite C [VHC]10), le succès de la greffe 11, le risque de troubles de la grossesse et le succès reproducteur12,13, la protection contre les rechutes après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) la transplantation14,15, 16et le risque de cancers17.

La combinaison d’homologie de séquence haute et alléliques et haplotypiques diversité présente défis dans la tâche de façon précise les gènes KIR génotypage. Les méthodes conventionnelles de type KIR gènes comprennent amorce séquence-spécifique (SSP) polymerase chain reaction (PCR)18,19,20, séquence spécifique oligonucléotide sonde PCR (SSOP)21, et laser assistée matrice desorption ionisation et l’heure de vol de spectrométrie de masse (MALDI-TOF MS)22. Les inconvénients de ces techniques sont qu’ils fournissent seulement partiel aperçu le génotype d’un individu tout en étant aussi laborieux à effectuer. Récemment le séquençage de prochaine génération (NGS) a été appliqué pour taper le locus KIR spécifiquement. Alors que cette méthode est très puissante, il peut être coûteux à exécuter, et c’est beaucoup de temps mener des contrôles approfondis de données et d’analyse.

qKAT est une méthode PCR quantitative de haut débit. Alors que les méthodes conventionnelles sont laborieux et fastidieux, cette méthode permet d’exécuter presque 1 000 échantillons d’ADN (génomique) génomiques en cinq jours et donne le génotype KIR , ainsi que le nombre de copies du gène. qKAT se compose de dix réactions multiplexes, dont chacun vise deux loci KIR et un gène de référence d’un nombre de copie fixée dans le génome (STAT6) utilisé pour la quantification relative du gène KIR copier le numéro23. Ce test a été utilisé avec succès dans les études portant sur les panneaux de la grande population et cohortes de la maladie sur les maladies infectieuses comme le VHC, des maladies auto-immunes comme le diabète de type 1 et des troubles de la grossesse comme la pré-éclampsie, ainsi que fournir une génétique base à des études visant à comprendre les NK cell function1,4,24,25,26.

Protocol

1. préparation et électrodéposition d’ADN Quantifier précisément la concentration de génomique à l’aide d’un instrument spectrophotométrique ou fluorimétrique. Diluer l’ADN à 4 ng/µL sur une plaque de 96 puits puits profonds. Inclure au moins un échantillon d’Adng de contrôle avec un nombre de copies connues et un contrôle sans modèle. Centrifuger les plaques 96 puits à 450 x g pendant 2 min. À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, répartir chaque échantillon en quatre exemplaires sur plaques 384 puits qPCR afin que chaque cupule a 10 ng d’ADN (2,5 µL/puits). Préparer au moins dix plaques 384 puits, un pour chaque réaction de qKAT. Si Adng est actuellement distribué depuis plus d’une plaque à 96 puits, effectuer un lavage de volume complet avec 2 % eau de Javel et eau ultrapure pour nettoyer les aiguilles du liquide système entre chaque plaque à 96 puits d’échantillons Adng de manutention. Sécher à l’air l’ADN en incubant les plaques 384 puits dans un endroit propre à température ambiante pendant au moins 24 h. 2. préparation des amorces et des sondes Remarque : qKAT se compose de dix réactions multiplexes. Chaque réaction comprend trois paires d’amorces et de trois sondes marquées fluorescence qui amplifient spécifiquement deux gènes KIR et gène une seule référence. Les sondes qui ont été publiés dans Jiang et al.,27 ont été modifiés afin que les oligonucléotides sont maintenant marqués avec ATTO colorants car ils offrent photostabilité améliorée et longues durées de vie. Pré-aliquotés d’amorces sont disponibles dans le commerce (voir Table des matières). Préparer des paires d’amorces pour chaque réaction selon les dilutions indiquées au tableau 1. Préparer les combinaisons de sonde pour chaque réaction conformément au tableau 1. Chaque sonde individuel avant de faire la combinaison de contrôle. 3. préparation du Mix Master NOTE Les volumes mentionnés ci-dessous sont pour effectuer une réaction de qKAT sur un ensemble de plaques de 10 x 384 puits. S’assurer que les échantillons d’Adng plaqués sur les plaques 384 puits soient complètement secs. Procéder à toutes les étapes sur la glace et garder les réactifs couverts contre l’exposition à la lumière autant que possible, puisque les sondes marquées fluorescence sont photosensibles et thermo. Décongeler le tampon de qPCR, apprêt et sonde aliquotes à 4 ° C. Sur la glace, préparer un mélange maître pour plaques de 10 x 384 puits en ajoutant 18,86 mL d’eau ultrapure, 20 mL de tampon de qPCR et 1 000 µL de combinaison d’amorces des 180 µL de combinaison des sonde (tableau 2). Répartir le mélange maître à travers une plaque de profondeur 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, pipetage 415 µL à chaque puits. Garder cette plaque dans une glacière couverte de la lumière. À l’aide d’un instrument de manipulation de liquides, distribuer 9,5 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque 384 puits avec Adng séchée. Sceller la plaque avec une feuille et le placer immédiatement à 4 ° C. Répétez ce processus pour les plaques restantes, veiller à ce que les aiguilles du liquide système de manutention sont lavés avec de l’eau entre chaque plaque. Centrifuger les plaques 384 puits à 450 x g pendant 3 min et les incuber à 4 ° C durant la nuit ou entre 6 à 12 h pour remettre en suspension l’ADN et à dissiper les bulles d’air. 4. qPCR Assay Après l’incubation durant la nuit, centrifuger à 450 g pendant 3 min dissiper les bulles d’air restantes. Aux fins de l’automatisation, brancher la machine de qPCR (p. ex., LightCycler 480) à un gestionnaire de la microplaque (voir Table des matières). Programme gestionnaire microplaque afin de placer les plaques dans la machine de qPCR partir d’un quai de stockage refroidi abri de la lumière.NOTE les essais devraient, en théorie, travailler sur d’autres machines de qPCR avec paramètres optiques compatibles. Utiliser les conditions suivantes de cyclisme : 95 ° C pendant 5 min, suivi de 40 cycles de 95 ° C pour 15 s et 66 ° C pendant 50 s, avec la collecte de données à 66 ° C. Une fois que la série est terminée, avoir le robot recueillir la plaque de la machine de qPCR et placez-le dans le dock de défausse. 5. après l’exécution de l’analyse Après amplification, calculer les valeurs de cycle (Cq) quantification à l’aide de la méthode maximale dérivée seconde ou la méthode des Points de lissage avec le logiciel de la machine de qPCR (voir Table des matières), suivant les étapes ci-dessous. Ouvrez le logiciel de qPCR et, dans l’onglet navigateur , ouvrez le fichier d’expérience de réaction enregistrée pour une plaque. Pour l’analyse en utilisant la méthode maximale dérivée seconde, sélectionnez l’onglet analyse et de créer une nouvelle analyse à l’aide de la méthode Abs Quant/Second dérivé du Max. Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Second dérivé du Max, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : Rx-MPO (où x est le nombre de réaction). Sélectionnez Filtre peigne et choisissez VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Cela garantit que les données recueillies pour STAT6 sont sélectionnées. Sélectionnez couleur Compensation pour VIC/HEX/Yellow555(533-580). Cliquez sur calculer. Répétez cette opération pour Fam (465-510) et Cy5/Cy5.5(618-660). Cliquez sur enregistrer le fichier. Pour l’analyse à l’aide de la méthode d’ajustement Points, sélectionnez Abs Quant/Fit Points dans l’onglet analyse. Dans la fenêtre Créer nouvelle analyse , sélectionnez le type d’analyse : méthode Abs Quant/Fit Points, sous-ensemble : tous les échantillons, programme : Amplification, nom : RxF-MPO (où x est le nombre de réaction). Sélectionnez les filtres corrects et les compensations de couleur pour STAT6 et chacun des gènes KIR (Fam/Cy5). Dans l’onglet Noiseband , sélectionner la bande de bruit d’exclure le bruit de fond. Dans l’onglet analyse , la valeur des points de lissage 3 et sélectionnez que show points de lissage. Cliquez sur calculer. Cliquez sur enregistrer le fichier. 6. l’exportation des résultats Dans le logiciel de qPCR, ouvrez le navigateur onglet sélectionnez Résultats Batch Export. Ouvrez le dossier dans lequel les fichiers de l’expérience sont enregistrés et transférer les fichiers dans la section droite de la fenêtre. Cliquez sur suivant. Sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier d’exportation. Sélectionnez le type d’analyse méthode Abs Quant/Second dérivé du Max ou Abs Quant/Fit Points. Cliquez sur suivant. Vérifiez que le nom du fichier, le dossier d’exportation et le type d’analyse sont correct et cliquez sur suivant pour démarrer le processus d’exportation. Attendez que l’ État d’exportation est Ok. L’écran passera automatiquement à l’étape suivante. Vérifiez que tous les fichiers sélectionnés ont été exportés avec succès pour que le nombre de fichiers a échoué = 0. Cliquez sur terminé. Utiliser les scripts split_file.pl et roche2sds.pl pour couper les plaques exportés en réactions individuelles pour chaque plaque.NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub. 7. copiez le numéro de calculs Ouvrez le logiciel d’analyse numéro copie (par exemple, CopyCaller). Sélectionnez importer fichier de résultats de PCR en temps réel et charger des fichiers texte créés par roche2sds.pl. Sélectionnez analyser et procéder à l’analyse de chaque sélection échantillon étalon avec nombre de copie connue ou en sélectionnant le numéro de copie plus fréquent. Voir tableau 5 pour le nombre de copies plus fréquent des gènes KIR généralement observées dans les populations d’origine européenne. 8. qualité des données vérifie Utilisez le script R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R de combiner des données de numéros de copie de toutes les plaques dans un tableur.NOTE les scripts sont fournis sur demande/GitHub. Revérifier les données brutes sur le logiciel d’analyse numéro de copie pour les échantillons qui ne respectent pas le déséquilibre de liaison connue (LD) pour KIR gènes (tableau 6).

Representative Results

Analyse numéro copie peut être effectuée en exportant les fichiers dans le logiciel d’analyse numéro de copie, qui fournit le nombre de copies prédites et estimée selon la méthode de ΔΔCq. On peut prédire le nombre de copies que soit basée sur le nombre de copie connue contrôle d’échantillons d’ADN sur la plaque ou en entrant le nombre de copies de gènes plus fréquent (tableau 5). La figure 1 montre les résultats d’une plaque pour une réaction qui cible KIR2DL4 et KIR3DS1, ainsi que le gène de référence STAT6. Le nombre de copies plus fréquent pour KIR2DL4, un gène de cadre dans le locus KIR , est deux copies, alors que le nombre de copies plus fréquent pour KIR3DS1, un gène activant, est une copie. Les résultats de la figure montrent les parcelles d’amplification PCR observées sur le logiciel de qPCR et les données de numéro de copie générées à partir des données de qPCR. Comme indiqué, le test est capable de distinguer entre 0, 1, 2, 3 et 4 nombre de copies de gènes KIR . Le logiciel d’analyse numéro de copie permet aussi une visualisation de la distribution du nombre de copies à travers la plaque comme un graphique en secteurs ou un graphique à barres. L’efficacité de la prédiction de nombre de copie est plus faible pour les échantillons ayant un plus grand nombre de copie. La qualité de tous les matériaux utilisés dans les réactions Adng, tampon, amorces et sondes, peut affecter la précision des résultats obtenus. Toutefois, une discordance dans les résultats est plus susceptible d’être causé par une variation de la concentration de l’ADN sur une plaque. La pureté de l’Adng extrait, qui peut être mesurée à l’aide de la 260/280 et 260/230 rapports, peut aussi avoir un effet sur la qualité. Un ratio 260/280 du ratio 1,8-2 et 260/230 du 2-2. 2 sont souhaitables. Une concentration de portée inégale de l’ADN à travers une plaque peut conduire à une forte variabilité du cycle seuil (Ct) entre les échantillons et une discordance dans la gamme du nombre estimé de copies. Les résultats de la Figure 2 montrent l’effet de que la disparité entre les valeurs det C sur une plaque peut avoir sur l’exactitude dans la prédiction du nombre de copies. La ligne rouge indique la fourchette du nombre estimé de copies pour un échantillon et, idéalement, devrait être aussi proche d’un entier que possible. Les données de numéro de copie, une fois analysées, peuvent être exportées dans un fichier de feuille de calcul dans un format de 96 puits. Nous avons utilisé un script R (disponible sur demande) pour combiner les données de numéro de copie de toutes les 10 plaques qui fonctionnent comme un ensemble dans un tableur. Les données publiées sur KIRs provenant pour la plupart des populations d’origine européenne permettent la prédiction des règles LD qui existent entre différents gènes dans le complexe de KIR 1. Ces prédictions sont utilisées pour effectuer des vérifications en aval sur l’exemplaire numéro résultats obtenus (tableau 6). Les échantillons qui ne sont pas conforment à la LD prévu entre les gènes pourraient contenir polymorphisme inhabituelle ou haplotypique variations structurales. Un organigramme décrivant le protocole est illustré à la Figure 3. Un outil appelé identificateur de Haplotype KIR (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) a été développé afin de faciliter l’imputation des haplotypes de l’ensemble de données. L’imputation fonctionne sur la base d’une liste de référence haplotypes observés dans une population d’origine européenne1. Toutefois, l’outil permet également pour un jeu personnalisé des haplotypes de référence à utiliser à la place. Trois dossiers distincts sont produisent ; le premier fichier répertorie toutes les combinaisons de haplotype pour obtenir un exemple, le deuxième fichier fournit une liste ajustée des combinaisons haplotypes disposant des plus hautes fréquences combinées et le troisième fichier répertorie les exemples qu’il ne peut pas être assignés des haplotypes. Non autorisation de cession des haplotypes pourrait servir d’indicateur des haplotypes roman. Figure 1 : résultats représentatifs d’une plaque pour la réaction numéro 5. (A), ce panneau affiche amplification parcelles. (B), ce panneau affiche copie nombre emplacements. (C), ce panneau montre la distribution de nombre de copie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2 : résultats représentatifs d’une plaque avec une concentration d’ADN variable pour la réaction numéro 5. (A), ce panneau affiche amplification parcelles. (B), ce panneau affiche copie nombre emplacements. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : diagramme de flux du protocole qKAT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Test Gènes Amorces avant Concentration (nM) Inverser les amorces Concentration (nM) Sondes Concentration (nM) N ° 1 3DP1 A4F 250 A5R 250 P4a 150 2DL 2 2DL2F4 400 C3R2 600 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 2 2DS2 A4F 400 A6R 400 P4a 200 2DL 3 D1F 400 D1R 400 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 3 3DL 3 A8F 500 A8R 500 P4a 150 2DS4Del 2DS4Del 250 2DS4R2 250 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 4 3DL1e4 B1F 250 B1R 125 P4b 150 3DL1e9 D4F 250 D4R2 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 5 3DS1 B2F 250 B1R 250 P4b 150 2DL 4 C1F 200 C1R 200 P5B – 2DL 4 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 6 2DL 1 B3F 500 B3R 125 P4b 150 2DP1 D3F 250 D3R 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 7 2DS1 B4F 500 B4R 250 P4b 150 2DL 5 D2F 500 D2R 500 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 8 2DS3 B5F 250 B5R 250 P4b 150 3DL2e9 D4F 250 D5R 125 P9 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 9 3DL2e4 A1F 200 A1R 200 P4a 150 2DS4FL 2DS4FL 250 2DS4R2 500 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 N° 10 2DS5 B6F2 200 B6R3 200 P4b 150 2DS4 C5F 250 C5R 250 P5B 150 STAT6 STAT6F 200 STAT6R 200 PSTAT6 150 Tableau 1 : combinaison et concentration des amorces et des sondes utilisées dans chaque réaction de qKAT 27 . Réaction Apprêt aliquotes (µL) Sonde aliquotes (µL) R1 3DP1 A4F A5R 2DL2F4 C3R2 EAU STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DL 2 100 100 160 240 200 80 80 60 60 60 R2 2DS2 A2F A6R D1F D1R EAU STAT6F STAT6R P4A P9 PSTAT6 2DL 3 160 160 160 160 160 80 80 80 60 60 Remarque : besoin 20 µL moins d’eau dans le MasterMix R3 3DL 3 A8F A8FB A8R 2DS4DELF 2DS4R2 EAU STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DS4DEL 100 100 200 100 100 200 80 80 60 60 60 R4 3DL1E4 B1F B1R D4F D4R2 EAU STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 3DL1E9 100 50 100 200 350 80 80 60 60 60 R5 3DS1 B2F B1R C1F C1R EAU STAT6F STAT6R P4B P5B – 2L 4 PSTAT6 2DL 4 100 100 80 80 440 80 80 60 60 60 R6 2DL 1 B3F B3R D3F D3R EAU STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 2DP1 200 50 100 200 250 80 80 60 60 60 R7 2DS1 B4F B4R D2F D2R EAU STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 2DL 5 200 100 200 200 100 80 80 60 60 60 R8 2DS3 B5F B5R D4F D5R EAU STAT6F STAT6R P4B P9 PSTAT6 3DL2E9 100 100 100 50 450 80 80 60 60 60 R9 3DL2E4 A1F A1R 2DS4WTF 2DS4R2 EAU STAT6F STAT6R P4A P5B PSTAT6 2DS4WT 80 80 100 200 340 80 80 60 60 60 R10 2DS5 B6F2 B6R3 C5F C5R EAU STAT6F STAT6R P4B P5B PSTAT6 2DS4TOTAL 80 80 100 100 440 80 80 60 60 60 Tableau 2 : Volumes (µL) de 100 µM amorce/sonde des solutions mères de faire primer et sonder les aliquotes de combinaison. Nom Direction modification de 5´ modification de 3´ Séquence (5′ →3′) Longueur TM % GC Exon Position P4a Sens FAM BHQ-1 TCATCCTGCAATGTTGGTCAGATGTCA 27 60 44,4 4 425-451 P4b Antisens FAM BHQ-1 AACAGAACCGTAGCATCTGTAGGTCCCT 28 62 50 4 576-603 P5B Sens ATTO647N BHQ-2 AACATTCCAGGCCGACTTTCCTCTG 25 60 52 5 828-852 P5B – 2DL 4 Sens ATTO647N BHQ-2 AACATTCCAGGCCGACTTCCCTCTG 25 61 56 5 828-852 P9 Sens ATTO647N BHQ-2 CCCTTCTCAGAGGCCCAAGACACC 24 60 62,5 9 1246-1269 PSTAT6 ATTO550 BHQ-2 CTGATTCCTCCATGAGCATGCAGCTT 26 62 50 Tableau 3 : liste des sondes utilisées en qKAT 1, 27. les colorants fluorescents utilisés à l’extrémité 5′ des sondes oligo P5b, P5b – 2 DL 4, P9 et PSTAT6 ont été modifiés aux colorants ATTO. Gène Amorces Direction Séquence (5´-3´) Longueur TM % GC Exon Position Amplicon (bp) Allèles peuvent être manqués 3DL2e4 A1F Vers l’avant GCCCCTGCTGAAATCAGG 18 52 61.1 4 399-416 179 3DL 2 * 008, * 021, * 027, * 038. A1R Marche arrière CTGCAAGGACAGGCATCAA 19 53 52,6 559-577 3DL 2 * 048 3DP1 A4F Vers l’avant GTCCCCTGGTGAAATCAGA 19 49 52,6 4 398-416 112 Aucun A5R Marche arrière GTGAGGCGCAAAGTGTCA 18 52 55,6 492-509 Aucun 2DS2 A2F Vers l’avant GTCGCCTGGTGAAATCAGA 19 49 52,6 4 398-416 111 Aucun A6R Marche arrière TGAGGTGCAAAGTGTCCTTAT 21 51 42,9 488-508 Aucun 3DL 3 A8Fa Vers l’avant GTGAAATCGGGAGAGACG 18 50 55,6 4 406-423 139 Aucun A8Fb Vers l’avant GGTGAAATCAGGAGAGACG 19 50 52,6 405-423 3DL 3 * 054, 3DL 3 * 00905. A8R Marche arrière AGTTGACCTGGGAACCCG 18 51 61.1 526-543 Aucun 3DL1e4 B1F Vers l’avant CATCGGTCCCATGATGCT 18 51 55,6 4 549-566 85 3DL 1 * 00505, 3DL 1 * 006, 3DL 1 * 054, 3DL 1 * 086, 3DL 1 * 089 B1R Marche arrière GGGAGCTGACAACTGATAGG 20 52 55 614-633 3DL 1 * 00502 3DS1 B2F Vers l’avant CATCGGTTCCATGATGCG 18 51 55,6 4 549-566 85 3DS1 * 047 ; peuvent se procurer 3DL 1 * 054. B1R Marche arrière GGGAGCTGACAACTGATAGG 20 52 55 614-633 Aucun 2DL 1 B3F Vers l’avant TTCTCCATCAGTCGCATGAC 20 52 50 4 544-563 96 2DL 1 * 020, 2DL 1 * 028 B3R Marche arrière GTCACTGGGAGCTGACAC 18 50 61.1 622-639 2DL 1 * 023, 2DL 1 * 029, 2DL 1 * 030 2DS1 B4F Vers l’avant TCTCCATCAGTCGCATGAA 19 51 47,4 4 545-563 96 2DS1 * 001 B4R Marche arrière GGTCACTGGGAGCTGAC 17 49 64,7 624-640 Aucun 2DS3 B5F Vers l’avant CTCCATCGGTCGCATGAG 18 53 61.1 4 546-563 96 Aucun B5R Marche arrière GGGTCACTGGGAGCTGAA 18 51 61.1 624-641 Aucun 2DS5 B6F2 Vers l’avant AGAGAGGGGACGTTTAACC 19 50 52,6 4 475-493 173 Aucun B6R3 Marche arrière TCCAGAGGGTCACTGGGC 18 53 66,7 630-647 2DS5 * 003 2DL 4 C1F Vers l’avant GCAGTGCCCAGCATCAAT 18 52 55,6 5 808-825 83 Aucun C1R Marche arrière CCGAAGCATCTGTAGGTCT 19 52 52,6 872-890 2DL 4 * 018, 2DL 4 * 019 2DL 2 2DL2F4 Vers l’avant GAGGTGGAGGCCCATGAAT 19 52 57,9 5 778-796 151 2DL 2 * 009 ; 782G changé à A. C3R2 Marche arrière TCGAGTTTGACCACTCGTAT 20 51 45 909-928 Aucun 2DS4 C5F Vers l’avant TCCCTGCAGTGCGCAGC 17 57 70.6 5 803-819 120 Aucun C5R Marche arrière TTGACCACTCGTAGGGAGC 19 52 57,9 904-922 2DS4 * 013 2DS4Del 2DS4Del Vers l’avant CCTTGTCCTGCAGCTCCAT 19 54 57,9 5 750-768 203 Aucun 2DS4R2 Marche arrière TGACGGAAACAAGCAGTGGA 20 53 50 933-952 Aucun 2DS4FL 2DS4FL Vers l’avant CCGGAGCTCCTATGACATG 19 53 57,9 5 744-762 209 Aucun 2DS4R2 Marche arrière TGACGGAAACAAGCAGTGGA 20 53 50 933-952 Aucun 2DL 3 D1F Vers l’avant AGACCCTCAGGAGGTGA 17 48 58,8 9 1180-1196 156 Aucun D1R Marche arrière CAGGAGACAACTTTGGATCA 20 50 45 1316-1335 2DL 3 * 010, 2DL 3 * 017, 2DL 3 * 01801 et 2DL 3 * 01802 2DL 5 D2F Vers l’avant CACTGCGTTTTCACACAGAC 20 52 50 9 1214-1233 120 2DL5B * 011 et 2DL5B * 020 D2R Marche arrière GGCAGGAGACAATGATCTT 19 49 47,4 1315-1333 Aucun 2DP1 D3F Vers l’avant CCTCAGGAGGTGACATACGT 20 53 55 9 1184-1203 121 Aucun D3R Marche arrière TTGGAAGTTCCGTGTACACT 20 50 45 1285-1304 Aucun 3DL1e9 D4F Vers l’avant CACAGTTGGATCACTGCGT 19 52 52,6 9 1203-1221 93 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 068 D4R2 Marche arrière CCGTGTACAAGATGGTATCTGTA 23 53 43,5 1273-1295 3DL 1 * 05901, 3DL 1 * 05902, 3DL 1 * 060, 3DL 1 * 061, 3DL 1 * 064, 3DL 1 * 065, 3DL 1 * 094N, 3DL 1 * 098 3DL2e9 D4F Vers l’avant CACAGTTGGATCACTGCGT 19 52 52,6 9 1203-1221 156 Aucun D5R Marche arrière GACCTGACTGTGGTGCTCG 19 54 63,2 1340-1358 Aucun STAT6 STAT6F Vers l’avant CCAGATGCCTACCATGGTGC 20 54 60 129 STAT6R Marche arrière CCATCTGCACAGACCACTCC 20 54 60 Tableau 4 : les séquences des amorces utilisées dans qKAT 1, 27. KIR gène 3DL 3 2DS2 2DL 2 2DL 3 2DP1 2DL 1 3DP1 2DL 4 3DL 1EX9 3DL 1EX9 3DS1 2DL 5 2DS3 2DS5 2DS1 2DS4Total 2DS4FL 2DS4DEL 3DL 2EX4 3DL 2EX9 Nombre de copies plus fréquent 2 1 1 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 2 1 1 2 2 Tableau 5 : Nombre de copies plus fréquent pour KIR gènes couramment observés dans les échantillons d’origine européenne. Règles de déséquilibre d’assemblage pour qKAT issu des populations européennes Vérification de numéro de copie 1 KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 et KIR3DL2 sont des gènes de cadre présents sur les deux haplotypes. KIR3DL3, KIR3DP1, KIR2DL4 et KIR3DL2 = 2 2 KIR2DS2 et KIR2DL2 sont en LD entre eux 2DS2=2 DL 2 3 KIR2DL2 et KIR2DL3 sont des allèles du même gène 2 DL 2+2 DL 3= 2 4 KIR2DP1 et KIR2DL1 sont en LD entre eux 2DP1=2 DL 1 5 Exon 4 du KIR3DL1 et KIR3DL2 est égal à exon 9 de KIR3DL1 et KIR3DL2 respectivement. 3DL1ex4=3DL1ex9 et 3DL2ex4=3DL2ex9 6 KIR3DL1 et KIR3DS1 sont des allèles 3 DL 1+3DS1= 2 7 KIR2DS3 et KIR2DS5 sont en LD avec KIR2DL5 2DS3+2DS5=2 DL 5 8 KIR3DS1 et KIR2DS1 sont en LD 3DS1=2DS1 9 Présence d’otal KIR2DS1 et KIR2DS4Test mutuellement exclusive sur un haplotype 2DS1+2DS4TOTAL= 2 10 KIR2DS4FL et KIR2DS4del sont des variantes du KIR2DS4TOTAL 2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL Tableau 6 : déséquilibre de liaison entre KIR gènes couramment observés dans les populations d’origine européenne peuvent être utilisés pour vérifier les données de numéros de copie 1,27.

Discussion

Nous avons décrit une nouvelle méthode semi-automatisée haut-débit, appelée qKAT, ce qui facilite la copie numéro typage des gènes KIR . La méthode est une amélioration par rapport aux méthodes conventionnelles comme fournisseur de services partagés-PCR, qui sont de faible débit et peut seulement indiquer la présence ou l’absence de ces gènes très polymorphes.

L’exactitude des données numéros copie obtenues dépend de multiples facteurs, y compris la qualité et la concentration-homogénéité des échantillons Adng et la qualité des réactifs. La qualité et la précision des échantillons Adng à travers une plaque sont extrêmement importantes car les variations de concentration à travers la plaque peuvent entraîner des erreurs dans le calcul du nombre de copie. Étant donné que les tests ont été validés à l’aide des ensembles d’échantillons origine européenne, données de cohortes provenant d’autres parties du monde exigent des vérifications plus approfondies. Il s’agit de faire en sorte que les instances de décrochage de l’allèle ou liaison non-spécifique apprêt/sonde ne sont pas interprété à tort comme variation numéro de copie.

Alors que les tests ont été conçus et optimisés pour exécuter en tant que haut-débit, ils peuvent être modifiés pour exécuter moins d’échantillons. La métrique de confiance dans le logiciel d’analyse numéro de copie est affectée lors de l’analyse des échantillons de moins, mais cela peut être améliorée si les échantillons d’ADN génomiques contrôle avec un nombre connu de la copie du gène KIR figurent sur la plaque et répétitions d’échantillonnage supplémentaires sont inclus.

Pour les laboratoires sans liquide/plaque-manutention robots, mélange principal peut être dispensée à l’aide de pipettes multicanaux et plaques peuvent être chargés manuellement dans l’instrument de qPCR.

L’objectif principal derrière le développement de qKAT devait créer une méthode simple, de haut débit, haute résolution et rentable au génotype KIRs pour maladie études d’association. Ceci a été réalisé avec succès puisque qKAT a été employé dans l’enquête sur le rôle de KIR dans plusieurs études d’association de grandes maladies, y compris une gamme de maladies infectieuses, maladies auto-immunes et grossesse troubles4, 24 , 25 , 26.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Le projet a reçu des fonds du Medical Research Council (MRC), le Conseil européen de la recherche (CER) en vertu du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (subvention, contrat n° 695551) et le National Institute of Health (NIH) de Cambridge Biomedical Research Centre et NIH recherche sang et Transplant Research Unit (NIHR BTRU) dans le don et la Transplantation de l’Université de Cambridge et en partenariat avec le sang de la NHS et transplantation (NHSBT). Les opinions exprimées sont celles des auteurs et pas nécessairement celles de la NHS, le NIHR, le ministère de la santé ou le NHSBT.

Materials

REAGENTS
Oligonucleotides Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 4
Probes labelled with ATTO dyes Sigma Custom order SEQUENCES: Listed in Table 3
SensiFAST Probe No-ROX Kit Bioline BIO-86020 −
MilliQ water − − −
NAME COMPANY CATALOG NUMBER COMMENTS
EQUIPMENT
Centrifuge with a swinging bucket rotor Eppendorf(or equivalent) Eppendorf 5810R or equivalent system
NanoDrop Thermo Scientific ND-2000
OR
QuBit Fluorometer Life Technologies Q33216
Matrix Hydra Thermo Scientific 109611
LightCycler 480 II Instrument 384-well Roche 05015243001
Twister II Microplate Handler with MéCour Thermal Plate Stacker (MéCour) Caliper Life Sciences 204135
Vortex mixer Biosan BS-010201-AAA
Single-channel pipettes (volume range: 0.5–10 µL, 2–20 µL, 20–200 µL, 200–1,000 µL; 1-10 mL) Gilson(or equivalent) F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
RNase- and DNase-free pipette tips filtered (10 µL, 20 µL, 200 µL, 1,000 µL, 10 mL) Starlab (or equivalent) S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
StarTub PS Reagent Reservoir, 55 mL STARLAB E2310-1010
50 mL Centrifuge Tube STARLAB E1450-0200
96-well deep well plate Fisher Scientific 12194162
LC480 384 Multi-well plates Roche 04729749001
LightCycler 480 Sealing Foil Roche 04729757001
NAME COMPANY CATALOG NUMBER COMMENTS
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Applied Biosystems CopyCaller Software v2.1 https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
KIR haplotype identifier http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/
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QKATQuantitative KIR Automated TypingKiller-cell Immunoglobulin-like ReceptorNK Cell Receptor GeneticsHaplotype DiversityDisease AssociationHigh-throughputGene Copy NumberMultiplex PCRReal-time PCRRelative QuantificationPopulation GeneticsHLAViral InfectionsCancerStem Cell TransplantationPregnancy Disorders

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Jayaraman, J., Kirgizova, V., Di, D., Johnson, C., Jiang, W., Traherne, J. A. qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes. J. Vis. Exp. (145), e58646, doi:10.3791/58646 (2019).
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