HIV関連肝病因に対する二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立
Summary
このプロトコルは、ヒト免疫系および肝細胞の両方を有するヒト化マウスを確立するための信頼性の高い方法を提供する。ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞の脾臓内注射を介して達成される二重再構成免疫不全マウスは、ヒト免疫不全ウイルス-1感染の影響を受けやすく、肝臓損傷を再キャパチレートするHIVに感染した患者
Abstract
ヒト免疫不全ウイルス-1(HIV-1)に感染した患者の平均余命が増加しているにもかかわらず、肝疾患は罹患率の一般的な原因として浮上している。HIV-1によって引き起こされる肝免疫病理学は、依然として不明なままである。ヒト肝細胞およびヒト免疫系を有する小さな異種移植片動物モデルは、疾患の病因のヒト生物学を要約することができる。本明細書において、ヒト肝細胞およびCD34+造血幹細胞/前駆細胞(HSPC)移植を介して二重ヒト化マウスモデルを確立するプロトコルが記載され、HIV感染患者で観察される肝臓免疫病理を研究する。二重再構成を達成するために、男性TK-NOG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgTm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic)マウスは、マウストランスジェニック肝細胞を排除するためにガンシクロビル(GCV)用量を経頭食内注射し、非筋筋形成調節のためのトレオスルファンを用いる。ヒト肝細胞(HEP)移植およびヒト免疫系(HIS)の発達を促進する。ヒトアルブミン(ALB)レベルは肝臓移植について評価され、フローサイトメトリーによって検出された血液中のヒト免疫細胞の存在は、ヒト免疫系の確立を確認する。ここで説明するプロトコルを使用して開発されたモデルは、HIV-1感染による肝臓損傷の複数の成分に似ています。その確立は、肝炎ウイルス共感染症の研究と抗ウイルス薬と抗レトロウイルス薬の評価のために不可欠であることが証明される可能性があります。
Introduction
抗レトロウイルス療法の出現以来、HIV-1単感染に関連する死亡が大幅に減少している。しかし、肝疾患はHIV感染患者1,2の罹患率の一般的な原因として現れた。HIV-1感染を伴う肝炎ウイルスの共感染はより一般的であり、米国ではHIV感染者の10%~30%を占める3、4、5を占めている。
HIV-1および肝炎ウイルスの宿主特異性は、ヒト特異的感染症を研究したり、HIV-1関連肝病因の複数の側面を調査するために、小動物モデルの有用性を制限する。ヒト細胞および/または組織の生着を可能にする免疫不欠性マウス(ヒト化マウスモデルと呼ばれています)は、前臨床試験6、7、8の許容可能な動物モデルである。2000年代初頭にヒト化マウスが導入されて以来、胆嚢突起ヒト肝毒性、HIV-1およびHIV関連神経認知障害を含むヒト特異的病原体、エプスタインバーウイルス、肝炎、および他の複数の前臨床研究感染症は、これらのマウス6、9、10、11で調査されている。CD34+HSPCおよび/またはヒト肝細胞移植のための複数のマウスモデルは、長い間開発され、B型肝炎ウイルス(HBV)関連肝疾患12の疾患病因を研究するために時間をかけて改善されてきた、13歳,14.HSPCおよびヒト肝細胞(HEP)移植のためのいくつかのモデルは、NOG(NOD)として知られている株に基づいている。Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15、 バルブ/C-ラグ2-/- γ-/- γ -/- (Rag2 tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flg tm1.1Flv/J)12、および fah-/- NOD ラグ1-/–il2rγヌルマウス16.ただし、各モデルには独自の長所と制限があります。例えば、BALb/C-Rag2上のHEPおよびヒト幹細胞(HSC)のAFC8二重ヒト化マウスは、免疫細胞およびHSCの正常な生着を可能にするが、抗原特異的なT細胞およびB細胞が存在しないこのモデル12での応答 .二重ヒト化マウスの再構成における主な懸念は、最適でない生着、異なる組織をサポートするための適切なモデルの欠如、不一致の状態、免疫拒絶反応、または移植片対宿主病(GVHD)、および技術的な新生児による危険な操作や代謝異常による死亡率の高さなどの困難13.
ヒト化マウスは17年、18年、19年のHIV研究に長年使用されてきたが、HIV-1による肝臓損傷を研究するヒト化マウスの使用は20件に制限されている。我々は以前に、二重ヒト化TK-NOGマウスモデルの確立とHIV関連肝疾患8におけるその応用を報告した。このモデルは、肝臓および免疫細胞の堅牢な生着を示し、HIV感染病因を要約する。この議論は、ヒト肝細胞移植における最も重要なステップを含む詳細なプロトコルを提示する。HEPの移植に成功するために必要なHSPCの説明とTK-NOGマウスにおける機能性免疫系の確立についても説明する。これらのマウスをHIV関連肝免疫病因の研究に用いることは詳細である。肝臓特異的ヘルペス単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV-TK)トランスジーンを担持するTK-NOG雄マウスが用いられる。このトランスジーンを発現するマウス肝細胞は、GCVの非毒性用量への短時間暴露後に容易にアブレートすることができる。移植されたヒト肝細胞は、外因性薬物なしでマウス肝臓内で安定に維持される21.マウスはまた、ヒト細胞8のマウス骨髄にニッチを作成するために、トレオスルファンの非骨髄切除用量で予め定められている。免疫不全のTK-NOGマウスは、HEPおよび多能性HSPCを神経中注射する。その後、マウスは、血液免疫の入力と血清ヒトアルブミンレベルの測定によって、血液および肝臓の再構成について定期的にモニタリングされる。ヒト免疫細胞とHEPの両方に対して15%以上の再構成に成功したマウスは、HIV-1を食前食内注射する。肝臓に対するHIVの効果は、早ければ4~5週間の感染後に評価することができる。HIV-1が使用されているので、ウイルスを処理し、マウスに注入する際に必要なすべての予防措置を取る必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
肝臓は、HIV感染患者24で侵害され、損傷を受けている。HIV-1の存在下でヒト肝疾患を研究するための実験的な小動物モデルは、CD34 +HSPCおよび肝細胞7、12を有するいくつかの共移植動物モデルの利用可能性にもかかわらず、極めて限られている。 25.インビトロ実験では、肝細胞は低レベルのHIV-1<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所の助成金R24OD018546(L.Y.P.およびS.G.)によって支援されました。著者らは、外科的処置の助けに対して、アマンダ・ブランチ・ウッズ、B.S.、免疫組織学のためのヤン・チェン、UNMCフローサイトメトリー研究施設メンバーのフィリップ・ヘクスリー、博士、ビクトリア・B・スミス、B.S.、サマンサの助けに感謝したいと思います。ウォール、B.S.、UNMCは、技術サポートのためのジャニスA.テイラー、B.S.、およびジェームズR.Talaska、B.S.の高度な顕微鏡検査コア施設メンバー。著者らは、TK-NOGマウスとヨアヒム・バウムガート博士がトレオスルファンを提供したことを認めている。著者は、原稿への彼女の編集貢献のために、UNMCのエイドリアン・コエスター博士に感謝しています。
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
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