Création du modèle de souris TK-NOG humanisé double pour la pathogénie du foie associée au VIH
Summary
Ce protocole fournit une méthode fiable pour établir des souris humanisées avec le système immunitaire humain et les cellules hépatiques. Les souris immunodéficientes doublement reconstituées réalisées par injection intrasplégique d’hépatocytes humains et de CD34– cellules souches hématopoïétiques sont sensibles à l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine-1 et récapitulent les lésions hépatiques observées dans patients infectés par le VIH.
Abstract
Malgré l’espérance de vie accrue des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine 1 (VIH-1), l’affection hépatique est devenue une cause fréquente de leur morbidité. L’immunopathologie hépatique causée par le VIH-1 reste insaisissable. Les petits modèles animaux de xénogreffe avec des hépatocytes humains et le système immunitaire humain peuvent récapituler la biologie humaine de la pathogénie de la maladie. Ici, un protocole est décrit pour établir un modèle de souris humanisée double par des hépatocytes humains et CD34– cellules hématopoïétiques de tige/progénitrice (HSPc) transplantation, pour étudier la pathologie immuno-hépatique telle qu’observée dans les patients HIV-infectés. Pour parvenir à une double reconstitution, hommes TK-NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) souris sont injectées par voie intrapéritone avec des doses de ganciclovir (GCV) pour éliminer les cellules transgéniques du foie de la souris, et avec treosulfan pour le conditionnement nonmyeloablatif, qui faciliter l’engraftment de l’hépatocyte humain (HEP) et le développement du système immunitaire humain (HIS). Les niveaux humains d’albumine (ALB) sont évalués pour l’engraftment de foie, et la présence des cellules immunitaires humaines dans le sang détecté par cytométrie de flux confirme l’établissement du système immunitaire humain. Le modèle développé à l’aide du protocole décrit ici ressemble à de multiples composants des dommages au foie causés par l’infection par le VIH-1. Sa mise en place pourrait s’avérer essentielle pour l’étude de la co-infection par le virus de l’hépatite et pour l’évaluation des médicaments antiviraux et antirétroviraux.
Introduction
Depuis l’avènement du traitement antirétroviral, il y a eu une diminution substantielle des décès liés à la monoinfection par le VIH-1. Cependant, l’affection hépatique est apparue comme une cause fréquente de morbidité chez les patients infectés par le VIH1,2. Les coinfections des virus de l’hépatite par infection par le VIH-1 sont plus fréquentes, représentant 10 % à 30 % des personnes infectées par le VIH aux États-Unis3,4,5.
La spécificité de l’hôte des virus du VIH-1 et de l’hépatite limite l’utilité des modèles de petits animaux pour étudier des maladies infectieuses spécifiques à l’homme ou pour étudier de multiples aspects de la pathogénie hépatique associée au VIH-1. Les souris immunodéficientes qui permettent l’engraftment des cellules et/ou des tissus humains (appelés modèles humanisés de souris) sont des modèles animaux acceptables pour des études précliniques6,7,8. Depuis l’introduction de souris humanisées au début des années 2000, de multiples études précliniques sur la toxicité du foie humain cholestatique, les agents pathogènes spécifiques à l’homme, y compris le VIH-1 et les troubles neurocognitifs associés au VIH, le virus Epstein Barr, l’hépatite et d’autres maladies infectieuses, ont été étudiés chez ces souris6,9,10,11. Plusieurs modèles de souris pour les CD34et les HSPC et/ou la transplantation d’hépatocytes humains ont été développés depuis longtemps et se sont améliorés au fil du temps pour étudier la pathogénie de la maladie de l’hépatite B (HBV)-associée à la maladie du foie12, 13 (en) , 14. Plusieurs modèles de transplantation de HSPC et d’hépatocytehumain humain (HEP) sont basés sur des souches, connues sous le nom de NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/– (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, et fah-/- NOD rag1-/- souris il2r-null16. Cependant, chaque modèle a ses propres avantages et limites; par exemple, les souris aFR8 doublement humanisées pour les PHE et les cellules souches humaines (HSC) sur un fond Balb/C-Rag2-/-C-/- permet l’engraftment réussi des cellules immunitaires et des HSC, mais il y a une absence d’un T- et d’un B-cellule réponse dans ce modèle12. Les principales préoccupations dans la reconstitution de souris double humanisées comprennent l’engraftment sous-optimal, l’absence de modèles appropriés pour soutenir différents tissus, des conditions dépareillées, le rejet immunitaire, ou la maladie degreffe-contre-hôte(GVHD), et technique difficultés, telles que les manipulations risquées avec les nouveau-nés et les taux de mortalité élevés dus à des anomalies métaboliques13.
Bien que les souris humanisées aient été utilisées pour la recherche sur le VIH depuis de nombreuses années17,18,19, l’utilisation de souris humanisées pour étudier les dommages au foie causés par le VIH-1 a été limitée20. Nous avons précédemment rapporté l’établissement d’un modèle de souris TK-NOG doublement humanisé et son application dans la maladie hépatique associée au VIH8. Ce modèle montre l’engraftment robuste des cellules hépatiques et immunitaires et récapitule la pathogénie d’infection par le VIH. Cette discussion présente un protocole détaillé, y compris les étapes les plus critiques dans la transplantation des hépatocytes humains. Une description des HSPC exigées pour une engraftment réussie des HEPs et l’établissement d’un système immunitaire fonctionnel dans les souris de TK-NOG est également présentée. L’utilisation de ces souris pour étudier l’immunopathogenèse hépatique associée au VIH est détaillée. Des souris mâles TK-NOG porteuses d’un transgène de type 1 de type 1 de type de thymidine kinase (HSV-TK) de type 1 de la kinase (HSV-TK) de type. Les cellules hépatiques de souris exprimant ce transgène peuvent facilement être alendues après une brève exposition à une dose non toxique de GCV. Les cellules du foie humain transplantées sont maintenues de façon stable dans le foie de souris sans médicaments exogènes21. Les souris sont également préconditionnées avec des doses non myélobolatives de treosulfan pour créer une niche dans la moelle osseuse de la souris pour les cellules humaines8. Les souris immunodéficientes de TK-NOG sont intrasplenically injectées avec des HEPs et des HSPC multipotents. Les souris sont alors régulièrement surveillées pour la reconstitution de sang et de foie par l’immunophénotypage de sang et les mesures des niveaux humains-albumins de sérum, respectivement. Les souris dont la reconstitution réussie est de plus de 15 % pour les cellules immunitaires humaines et les PHE sont injectées par voie intrapéritone avec le VIH-1. L’effet du VIH sur le foie peut être évalué dès 4 à 5 semaines après l’infection. Il est essentiel de noter que, parce que le VIH-1 est utilisé, toutes les précautions nécessaires doivent être prises lors de la manipulation du virus et de l’injecter chez la souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le foie est compromis et endommagé chez les patients infectés par le VIH24. Les modèles expérimentaux de petits animaux pour étudier les maladies du foie humain en présence du VIH-1 sont extrêmement limités, malgré la disponibilité de quelques modèles animaux cotransplantés avec CD34et HSPc et hépatocytes7,12, 25. Dans les expériences in vitro, il est démontré que les hépatocy…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention r24OD018546 de l’Institut national de la santé (à L.Y.P. et S.G.). Les auteurs tenons à remercier Weizhe Li, Ph.D., pour l’aide dans les procédures chirurgicales, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng pour l’immunohistologie, les membres de l’installation de recherche sur la cytométrie des flux de flux de l’UNMC Directeur Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., et Samantha Wall(S.-B.), membres avancés de l’installation de microscopie de l’UNMC, Janice A. Taylor, B.S., et James R. Talaska, B.S., pour le soutien technique. Les auteurs reconnaissent les Drs Mamoru Ito et Hiroshi Suemizu de la CIEA pour avoir fourni des souris TK-NOG et le Dr Joachim Baumgart pour avoir fourni des treosulfan. Les auteurs remercient le Dr Adrian Koesters, UNMC, pour sa contribution éditoriale au manuscrit.
Materials
| 27G1/2" needles | BD biosciences | 305109 | |
| 30G1/2" needles | BD biosciences | 305106 | |
| 5 mL polystyrene round-bottom tube 12 x 75 mm style | Corning | 352054 | |
| BD 1 mL Tuberculin Syringe Without Needle | BD biosciences | 309659 | |
| BD FACS array bioanalyzer | BD Biosciences | For purity check of eluted CD34+ cells | |
| BD FACS array software | BD Biosciences | Software to analysis acquired CD34+ cell on FACS array | |
| BD FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | To lyse red blood cells |
| BD LSR II | BD Biosciences | Instrument for acquisiton of flow cytometry samples | |
| BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tube | BD biosciences | BD 367874 | To collect Cord blood |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-aldrich | A9576 | |
| Buprenorphine | Controlled substance and pain-killer | ||
| CD14-PE | BD Biosciences | 555398 | Specific to human |
| CD19-BV605 | BD Biosciences | 562653 | Specific to human |
| CD34 MicroBead Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For isoation of CD34+ HSPC |
| CD34-PE, human | Miltenyi Biotec | 130-081-002 | Antibody used for purity check of eluted CD34+ cells |
| CD3-AF700 | BD Biosciences | 557943 | Specific to human |
| CD45-PerCPCy5.5 | BD Biosciences | 564105 | Specific to human |
| CD4-APC | BD Biosciences | 555349 | Specific to human |
| CD8-BV421 | BD Biosciences | 562428 | Specific to human |
| Cell counting slides | Bio-rad | 1450015 | |
| ChargeSwitch gDNA Mini Tissue Kit | Thermofisher scientific | CS11204 | for extraction of genomic DNA from ear piece |
| Cobas Amplicor system v1.5 | Roche Molecular Diagnostics | bioanalyzer to measure viral load | |
| Cotton-tipped applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Cytokeratin-18 (CK18) | DAKO | M7010 | Specific to human |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-aldrich | D2650-5X5ML | |
| Extension set Microbore Slide Clamp(s) Fixed Male Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0.55 mL Fluid Path Sterile | BD biosciences | 30914 | Attached to dispensing pippet and to load with HSPC and HEP suspesion |
| FACS Diva version 6 | BD Biosciences | flow cytometer software required for acqusition of sample | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438026 | |
| FLOWJO analysis software v10.2 |
FLOWJO, LLC | flow cytometry analysis software | |
| Ganciclovir | APP Pharmaceuticals, Inc. | 315110 | Prescripition drug |
| Greiner MiniCollect EDTA Tubes | Greiner bio-one | 450475 | |
| Hepatocytes thawing medium | Triangle Research Labs | MCHT50 | |
| Horizon Open Ligating Clip Appliers | Teleflex | 537061 | To hold the ligating clips |
| Hospira Sterile Water for Injection | ACE surgical supply co. Inc. | 001-1187 | For dilution of Buprenorphine (pain-killer) |
| Human Albumin ELISA Quantitation Set | Bethyl laboratories | E80-129 | For assesing human albumin levels in mouse serum |
| Human hepatocyte | Triangle Research Labs | HUCP1 | Cryopreserved human hepatocytes, induction qualified |
| Iris Scissors, Straight | Ted Pella, Inc. | 13295 | |
| Lancet | MEDIpoint | Goldenrod 5 mm | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used to entrap CD34+ microbeads (positive selection) |
| Lymphocyte Separation Medium (LSM) | MP Biomedicals | 50494 | For isoation of lymphocytes from peripheral blood |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | holds Qudro MACS seperator and LS columns |
| McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5605 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Micro Dissecting Forceps | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5157 | to hold and pull out spleen from peritoneal cavity |
| mouse CD45-FITC | BD Biosciences | 553080 | mouse-specific |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Hyclone | SH30256.02 | |
| Qudro MACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | holds four LS columns |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 11875093 | |
| StepOne Plus Real Time PCR | Applied Biosystems | Instrument used to genotype | |
| Stepper Series Repetitive Dispensing Pipette 1ml | DYMAX CORP | T15469 | Used to dispense HSPC and HEP supension in controlled manner |
| Suturevet PGA synthetic absorbale suture | Henry Schein Animal Health | 41178 | Suturing of skin and peritoneum |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermofisher scientific | 4369016 | |
| TC20 automated cell counter | Bio-rad | 1450102 | |
| TK-NOG mice | Provided by the Central Institute for Experimental Animals (CIEA, Japan; Drs. Mamoru Ito and Hiroshi Suemizu) | ||
| Treosulfan | Medac GmbH | Provided by Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) | |
| Trypan Blue | Bio-rad | 1450022 | |
| Vannas-type Micro Scissors, Straight, 80mm L | Ted Pella, Inc. | 1346 | Used to make an incision on skin to expose spleen |
| Weck hemoclip traditional titanium ligating clips | Esutures | 523700 | To ligate the spleen post-injection |
References
- Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
- Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
- Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
- Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
- Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, 47-58 (2012).
- Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
- Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
- Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
- Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
- Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
- Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
- Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
- Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
- Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820 (2015).
- Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
- Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
- Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. . Humanized Mice for HIV Research. , (2014).
- Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817 (2018).
- Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
- Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
- Hasegawa, M., et al. The reconstituted ‘humanized liver’ in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
- Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
- Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
- Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
- Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, 120-124 (2013).
- Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
- Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
- Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
- Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
- Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
- Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).
