Raumzeitlich kontrollierte nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekulare Leime als Photoactivatable Tags
Summary
Dieses Protokoll beschreibt Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit Käfig molekularen Klebstoff-Tags. Diese Methode ist viel versprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery.
Abstract
Der Zellkern ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten. Hier zeigen wir, dass Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste mit molekularen Klebstoff (CagedKleber-R) Tags, sperrte deren mehrere Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger von einer anionischen Photocleavable Gruppe (Butyrat-substituierten geschützt sind Nitroveratryloxycarbonyl; BA SVOC). Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und bleiben in Endosomen. Allerdings wird auf Photoirradiation, CagedKleber-R in uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger umgewandelt, die Endosomal entweichen und anschließenden nuklearen Translokation der Gäste erleichtert. Diese Methode ist vielversprechend für Website-selektiv-targeting Drug-Delivery, da tagged Gäste in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern übergehen können nur dann, wenn Photoirradiated. Im Käfig Kleber-R Tags können makromolekularen Gäste wie Quantenpunkte (QDs) sowie kleine Molekül Gäste liefern. Im Käfig Kleber-R Tags sind uncaged mit nicht nur UV-Licht, sondern auch zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht, das tief in das Gewebe eindringen kann.
Introduction
Der Zellkern, der genetischen Information trägt, ist eines der wichtigsten Organellen als subzelluläre Drug Delivery-Ziel seit Modulation der gen-Replikation und Ausdruck ist wirksam zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs und genetische 1,2,3-Störungen. Für nukleare Lieferung von Medikamenten Konjugation von Peptid Stichwörter wie nukleare Lokalisierung Signale (NLS)4,5,6 allgemein untersucht worden ist. Um unerwünschte Nebenwirkungen zu reduzieren, ist jedoch räumlich-zeitliche Kontrolle der nuklearen Translokation notwendig.
Zuvor wurde Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern mit Käfig NLS7,8,9erreicht. NLS wandert in den Zellkern durch die Bindung an zytoplasmatischen Transport Proteine6. In den gemeldeten Methoden sind Gast Proteine mit Käfig NLS direkt in das Zytoplasma durch Mikroinjektion8 integriert oder in den Zielzellen mit einem genetischen Code Ausbau Technik9ausgedrückt. Daher ist eine Methode, die zelluläre Aufnahme und Foto-induzierte nuklearen Translokation erreichen kann vorteilhaft für praktische Anwendungen.
Hier beschreiben wir Licht ausgelöste nukleare Translokation der Gäste in lebenden Zellen mit dendritischen eingesperrte molekularen Klebstoff (CagedKleber-R, Abb. 1) Tags. Wasserlösliche Leime molekulare10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 mit mehreren Gu+ -Anhänger sind bereits entwickelt worden, die halten uns fest an Proteine11,12,13,14,15, 16,17, Nukleinsäuren18,19,20, Phospholipid-Membranen-21und Ton Nanosheets22,23 durch die Bildung von zahlreichen Salz Brücken zwischen ihren Gu+ -Anhänger und Oxyanionic Gruppen auf die Ziele. Die Gu+ -Anhänger CagedKleber-r sind durch einen anionischen Photocleavable Gruppe, Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Gäste, die mit dem Stichwort CagedKleber-R sind berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose und Aufenthalt in Endosomen (Abbildung 2). Auf Photoirradiation sind die BASVOC Gruppen von CagedKleber-R freistehend ein uncaged molekularen Klebstoff (UncagedKleber-R) tragen mehrere Gu+ Anhänger nachzugeben, dann die Migration von tagged Gast erleichtert in das Zytoplasma, gefolgt von den Zellkern (Abbildung 2). Caged-Kleber-R-Tag kann durch die Einwirkung von UV- oder zwei-Photon Nah-Infrarot (NIR) Licht ohne schwere Phototoxizität uncaged. Wir demonstrieren die raumzeitlich kontrollierte nukleare Lieferung von makromolekularen Gäste sowie kleine Molekül Gäste mit CagedKleber-R Tags Quantenpunkte (QDs) mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Nitrobenzoxadiazole; NBD), bzw. als Beispiele.
Abbildung 1: Schematische Strukturen der CagedKleber-R. Die 9 Guanidinium Ion (Gu+) Anhänger CagedKleber-r sind von einer Gruppe von Butyrat ersetzt Nitroveratryloxycarbonyl (BASVOC) geschützt. Die BA-SVOC-Gruppen sind durch Bestrahlung mit UV- oder zwei-Photon NIR Licht gespalten. Die fokale Kern CagedKleber-R ist mit Nitrobenzoxadiazole (NBD) oder Dibenzocylooctyne (DBCO) funktionalisiert. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Licht-ausgelösten nuklearen Translokation Gäste konjugiert mit einem CagedKleber-R Tag. Der Gast /CagedKleber-R Konjugat berücksichtigt lebenden Zellen über Endozytose. Auf Photoirradiation ist das CagedKleber-R Tag uncaged die Bezeichnung für einen Uncaged-Kleber-R, weichen, der Endosomal Entweichen von der tagged Gast erleichtern kann. Anschließend wandert der tagged Gast in den Zellkern. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von Referenz-20. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vorausgegangenen Untersuchungen Licht ausgelöst Translokation von Proteinen in den Zellkern sind mit Käfig NLS7,8,9erreicht worden. Wie bereits erwähnt, erfordern diese Methoden zusätzliche Techniken, die NLS-markierten Proteine in das Zytoplasma zu integrieren. Im Gegensatz dazu ermöglicht unser Caged-Kleber-R-Tag nicht nur Foto-induzierte nuklearen Translokation, sondern auch zelluläre Aufnahme der Gäste. Die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir anerkennen das Zentrum für NanoBio Integration, der University of Tokyo. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Beihilfe für junge Wissenschaftler (B) (26810046), K.O. und teilweise unterstützt von Beihilfe für speziell gefördert Forschung (25000005), t.a. r.m. Dank der Research Fellowships der Japan Society für die Förderung der Wissenschaft (JSPS ) für junge Wissenschaftler und das Programm für die führenden Graduate Schools (GPLLI).
Materials
| Azide-PEG4-NHS ester | Click Chemistry Tools | AZ103 | |
| Q-dot 655 ITK | Invitrogen | Q21521MP | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 3,500) | NIPPON Genetics | TOR-3K | |
| Regenerated cellulose membrane (MWCO 25,000) | Harvard Apparatus | 7425-RC25K | |
| Hep3B Cells | ATCC | HB-8064 | |
| 8-chambered glass substrate | Nunc | 155411JP | |
| 96-well culture plate | Nunc | 167008 | |
| Eagle's minimal essential medium (EMEM) | Thermo Fisher Scientific | 10370-021 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare | SH30406.02 | |
| Dulbecco's phosphate buffer saline (D-PBS) | Wako Pure Chemical Industries | 045-29795 | |
| LysoTracker Red | Lonza Walkersville | PA-3015 | |
| Hoechst 33342 | Dojindo | H342 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Confocal laser scanning microscope | Carl-Zeiss | LSM 510 | Equipped with two-photon excitation laser (Mai Tai laser, Spectra-Physics) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| Xenon light source | Asahi Spectra | LAX-102 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax Paradigm |
References
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