Stres pozlama ile ilişkili epigenetik değişiklikleri tanımlamak için bir fare metil-Seq Platform

Tüm deneyler uygun olarak ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite toplantısında Johns Hopkins Tıp Fakültesi de dahil olmak üzere tüm ilgili yasal ve kurumsal yönergeleri, uyum içinde tamamlandı. 1. hayvanlar Erkek ergen Sprague-Dawley rat 4 haftalık edinin. Bir sıcaklık Polikarbonat sıçan kafeslerde hayvanlar ev- ve nem kontrollü oda bir 12 h ışık, 12 h karanlık döngü ile 0600 h., ışık başlangıçlı üzerinde ad libitum access su hayvanlarla sağlamak. Fareler ile ilgili stres azaltmak 1 hafta alışmana izin. Çift-ev hayvanları (N = 16) yalıtım stres engel ve kronik değişken 5 hafta-in yaş, başlamak için 3 hafta boyunca (CVS) rejimi stres. 2. kronik değişken stres CVS rejimi sabah (9-11: 00) bir kez ve bir kez öğleden sonra (1-3 PM) düzensiz zaman rutin öngörülemeyen tutmak için yönetmek. Gecede hafif stres dahil. CVS rejimi içerir: 1) 3 h bir kısıtlama silindir; 2) 10 dk Yüzme; 3) 3 h kafes eğimli 4) 1 h platformu; sallayarak yavaş ve 5) 4 ° C soğuk odada 1 h.Not: Gece stresler (5-kafes) sosyal dışlama etkisi, sosyal izolasyon, ıslak yatak, Gıda kısıtlama içerir ve ışıklar açıkken. Stres rejimi bir normal haftalık zamanlama Tablo 1′ de verilmiştir. 3. endokrin deneyleri Kuyruk kan (~ 50 mL) dağıtımları kullanarak corticosterone (CORT) düzeyleri temel hormon düzeyleri (0 gün), bir kez haftalık CVS ortasında sırasında kurmak için önceden CVS rejimi için aynı zamanda (9 AM) deneme boyunca haftada iki kez toplanan belirlemek (gün 4,11 ve 18), CVS her 7 gün sonra (gün 7 ve 14) ve CVS (21 gün) ve sonuç. Günlük stres alay önce kan örnekleri toplamak. Bir son gövde kan örneği ötenazi (gün 25) sırasında RIA ve genomik DNA ekstraksiyon için toplamak. Tüm kan örnekleri (600 x g, 4 ° C, 10 dk) plazma kan hücrelerinden ayırmak için santrifüj kapasitesi. Damlalıklı plazma (süpernatant) dışarı ve örnekleri-80 ° C’de depolayın Çözülme ve plazma radioimmunoassay (RIA) tarafından CORT düzeylerini belirlemek için kullanın. 3 hafta plazma CORT düzeyleri stres rejimi sağlamlık doğrulamak için stresli hayvanlarda yüksek emin olun. 4. davranış CVS rejimi sonra (gün 23-24), her hayvan için yüksek anksiyete gibi davranış değerlendirmek artı labirent (EPM)14. Bir video kamera kaydı ile hayvanlar üzerinde 300 s ve zaman ortasında, harcanan puanı için EPM aleti silah kapalı ve açık kollar açık. 5. fare metil-Seq tasarımını UCSC genom tarayıcı kullanarak, yedek genomik koordinatları (sıçan Kasım 2004 rn4 derleme) CpG adaları ve ada sahilleri (± 1 CpG adaları kanat kb), organizatör (± 1 kb her TSS ‘) her RefSeq gen ve üzerinden kullanılabilir olan diğer sahneleri için elde ilgili belgeleri.Not: fare metil-Seq için önceki bir dizi tabanlı metilasyonu platform üzerinden ek GC zengini diziler eklendi12. 5 kbps büyük bölgeleri için 500 bps alternatif bölgelerinde 1 kbps tarafından atlandı takip örneklenmiş. Son fare metil-Seq tasarım 111 Mbps, 2.3 milyon CpGs oluşur; ve 594 bps bir ortalama bölge boyutu. 228,800 benzersiz loci hedefler. Genomik koordinatları derlenmiş bir liste için uygun prob tasarım bir piyasada bulunan hedef yakalama tasarım yazılımı girin. 6. genomik DNA sıçan metil-Seq kitaplığından inşaatı Not: toplu iş etkileri ortadan kaldırmak için aynı anda birden fazla örnekleri işleme ve buna göre ana karışımları kadar ölçek. Piyasada bulunan bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA ayıklayın. Yöntemleri her iki sütun veya yağış alan verim yüksek kaliteli genomik DNA (260/280 oranı ~ 1.8). Fenol dayalı yöntemlerin kullanımı tavsiye edilmez. Elute veya düşük TE arabellekte (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8.0) DNA resuspend. Numune hazırlamaNot: DNA’ya bağlanıcı kullanarak her adım için manyetik boncuklar, boncuklar için oda sıcaklığında en az 30 dk için acclimated ve iyi karışık kullanmadan önce emin olun. DNA kesme Bir yer her örneğinin ilk çift iplikçikli DNA konsantrasyonu belirlemek için kullanın. Seyreltik > gDNA düşük TE arabelleği (10 mM TE, 0,1 mM EDTA, pH 8.0) düşük DNA’ya bağlanıcı microcentrifuge tüpler ile 50 µL için 1 µg. İzotermal bir sonicator kullanarak örnekleri kesme (% 10 iş hacmi, 5 yoğunluğu, 200 devir-veri bloğu, 6 döngüleri 60 s, frekans süpürme, 4 ° C). DNA boyutu ve miktar ölçer Elektroforez tabanlı sistemi kullanılarak DNA kalitesini değerlendirmek.Not: önerilen DNA 1 µg veya 3 µg tutardır. Malzeme başlayan sınırlı varsa, en düşük giriş tutarı olmalıdır > 500 ng, daha düşük miktarlarda olumsuz etkiler miktar ve kalitesini oluşturulan kitaplıkları. Onarım DNA biter. Buz üstünde son-onarım Master Mix hazırlamak için fareyi metil-Seq seti kullanın. Her örnek için 52 µL karışımı ekleyin ve ısıtmalı kapak (için 30 dk, 4 ° C tutun 20 ° C) olmadan bir termal cycler kuluçkaya.Son onarım Master Mix (örnek) başına:Su 35.2 µLSon onarım arabelleği 10 µL (10 x)DNTP Mix 1.6 µLT4 DNA polimeraz 1 µLKlenow DNA polimeraz 2 µLT4 polinükleotit kinaz 2.2 µL 180 µL DNA’ya bağlanıcı manyetik boncuklar ve taze hazırlanmış % 70 etanol örnek başına 400 µL kullanarak örnekleri arındırmak. Her örnek için 180 µL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve Pelet % 70 etanol 200 µL içinde resuspend. Etanol kaldırmak ve yıkama bir kez yinelenir. Manyetik bir tabak boncuk cips ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Kuru bir 37 ° C olarak heatblock 3-5 dk kadar boncuk Pelet tamamen kuru. Nükleaz ücretsiz su 44 µL içinde resuspend ve yaklaşık 42 µL süpernatant ile toplamak.Durdurma noktası: tamir DNA sona erdikten sonra örnekleri olabilir mühürlü ve -20 ° C’de depolanan Adenilat 3’ biter. Adenylation Master Mix buzda hazırlayın. Her örnek için 9 µL karışımı ekleyin ve ısıtmalı kapak (37 ° C 30 dk, 4 ° C tutmak için) olmadan bir termal cycler kuluçkaya.Adenylation Master Mix (örnek) başına:Klenow arabellek 5 µLDATP 1 µLKlenow DNA polimeraz 3 µL 90 µL DNA’ya bağlanıcı manyetik boncuklar ve taze hazırlanmış % 70 etanol örnek başına 400 µL kullanarak örnekleri arındırmak. Her örnek için 90 µL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve Pelet % 70 etanol 200 µL içinde resuspend. Etanol kaldırmak ve yıkama bir kez yinelenir. Manyetik bir tabak boncuk cips ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Kuru bir 37 ° C olarak heatblock 3-5 dk kadar boncuk Pelet tamamen kuru. Nükleaz ücretsiz su 35 µL içinde resuspend ve yaklaşık 33,5 µL süpernatant ile toplamak. Metillenmiş bağdaştırıcı ligate. Tüp ligasyonu Master Mix buz üzerinde hazırlamak ve her örnek için 16,5 µL karışımı ekleyin. Isıtmalı kapak (15 dakika, 4 ° C tutun 20 ° C) olmadan bir termal cycler kuluçkaya.(Örnek) başına ligasyonu Master Mix:Su 2.5 µLMetil-Seq 2.5 µL bağdaştırıcısı metillenmiş10 µL T4 DNA ligaz arabelleği (5 x)T4 DNA ligaz 1,5 µL 90 µL DNA’ya bağlanıcı manyetik boncuklar ve taze hazırlanmış % 70 etanol örnek başına 400 µL kullanarak örnekleri arındırmak. Her örnek için 90 µL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve Pelet % 70 etanol 200 µL içinde resuspend. Etanol kaldırmak ve yıkama bir kez yinelenir. Manyetik bir tabak boncuk cips ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Kuru bir 37 ° C olarak heatblock 3-5 dk kadar boncuk Pelet tamamen kuru. Nükleaz ücretsiz su 22 µL içinde resuspend ve yaklaşık 22 µL süpernatant ile toplamak. Bir bioanalyzer kullanarak kalitesini değerlendirmek.Not: DNA’ın toplam tutarı 500 ng, yamultma ve işlem ek DNA sonraki adımlara geçmeden önce olup olmadığını. Ortalama DNA boyutu daha–dan 30 bps tarafından artırmaz, reaktifleri yeni, T4 DNA polimeraz, Klenow ve/veya T4 ligaz eski olabilir emin olmak için denetleyin.Durdurma noktası: metillenmiş bağdaştırıcısı’birleştirilmesi (ligasyon) sonra örnekleri olabilir mühürlü ve -20 ° C’de depolanan Hibridizasyon Örnekleri düşük DNA’ya bağlanıcı microcentrifuge tüpler için transfer edecek ve ısıtmalı vakum yoğunlaştırıcı az 3.4 µL. Reconstitute örnekleri 3.4 µL için numune hacmi azaltmak için.Not: Örnekleri örnekleri tüm sıvı önce vakum yoğunlaştırıcı kaldırılır emin olmak için yaklaşık ~ 3 µL için konsantre buharlaşır. Hibridizasyon arabellek oda sıcaklığında ve metil-Seq blok Mix buzda hazırlayın. Her örnek için 5.6 µL metil-Seq blok karışımı ekleyin ve termal cycler (95 ° C 5 min, 65 ° C için 2 dk, 65 ° C tutmak için) kuluçkaya.Hibridizasyon arabellek (örnek) başına:Metil-Seq Hyb 1 6.63 µLMetil-Seq Hyb 2 0,27 µLMetil-Seq Hyb 3 2,65 µL4 metil-Seq Hyb 3.45 µLMetil-Seq blok Mix (örnek) başına:Metil-Seq dizin oluşturma blok 1 2.5 µLMetil-Seq blok 2 2.5 µLMetil-Seq blok 3 0.6 µL RNase blok Mix ve Kütüphane yakalama hibridizasyon karışımı hazırlayın. Her örnek için 20 µL yakalama Kütüphane hibridizasyon karışımı ekleyin ve 65 ° c en az 16 h için kuluçkaya.RNase blok Mix (örnek) başına:RNase blok 0.5 µLSu 1,5 µLKütüphane hibridizasyon Mix (örnek) yakalama:Hibridizasyon arabelleği 13 µLRNase blok Mix 2 µLSıçan metil-Seq 5 µL yakalama KütüphaneNot: Non-spesifik bağlama önlemek için hibridizasyon Mix eklerken reaksiyonlar 65 ° C’de tutmak . Aliquot 50 µL streptavidin manyetik boncuklar örnek yeni bir 8-şey şerit tüp içine başına. Boncuk 200 µL metil-Seq bağlama arabellek ile yıkayın. Manyetik plaka boncuk cips ve süpernatant 3 yıkama olmak üzere toplam her yıkama arasında kaldırmak için kullanın. Son yıkama sonra streptavidin boncuk metil-Seq bağlama arabellek 200 µL içinde resuspend. Yıkanmış streptavidin manyetik boncuklar 200 µL için örnekleri ekleyin ve 30 dk dönen bir mikser kullanarak için oda sıcaklığında kuluçkaya. Karıştırma, metil-Seq yıkama tampon 2 aliquot 200 µL 96-şey plaka başına örnek ve 65 ° C’ye önceden ısıtmak için bir termal cycler yerde onaylatılacak kuyu içine süre Streptavidin manyetik boncuklar Manyetik plaka kullanarak kuluçka sonra cips ve 200 µL boncuk resuspend metil-Seq yıkama tampon 1. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Cips ve süpernatant atmak için manyetik bir tabak kullanın. Boncuk metil-Seq yıkama tampon 2 ile 3 kez yıkayın: arabellek (adım 6.2.5 önceden ısındı.) 2 yıkama 200 µL boncuk Pelet resuspend, termal cycler (65 ° C, 10 dk) boncuklar kuluçkaya ve cips boncuk. Süpernatant manyetik bir tabak kullanarak her yıkama sonra atın.Not: hibridizasyon reaksiyonlar 65 ° C’de yıkama tampon 2 non-spesifik bağlama önlemek için eklerken korumak. Metil-Seq elüsyon arabelleği 20 µL yıkanmış boncuk ekleyin ve 20 dk. kullanım Pelet boncuk ve yeni bir şerit tüp süpernatant aktarmak için manyetik bir tabak için oda sıcaklığında kuluçkaya. Boncuk atmak.Not: kuluçka sırasında bisülfit dönüşüm reaktif hazırlayın. Bisülfit dönüştürmeNot: uygun reaktifler ve ticari olarak mevcut bisülfit dönüşüm kiti yönergeleri kullanarak eluted ssDNA bisülfit dönüştürme gerçekleştirmek. 130 µL hazırlanan bisülfit dönüşüm reaktif süpernatant için önceki adımı ekleyin. Her biri 150 µL reaksiyonlar eşit iki kuyu içine bölün. Termal cycler (2,5 h, 4 ° C tutun 64 ° C) kuluçkaya.Not: 150 µL tepki homojen sıcaklık emin olmak için iki ayrı kuyu eşit olarak bölünür. 2,5 h için kuluçka sonra hemen bir sonraki adıma geçin. Sütun bağlama arabellek 600 µL ekleyerek spin ve bir kez yıkama arabellek 100 µL ile yıkamak için örnekleri bağlayın. Sütunlar (15.000 x g, 1 dk) tüm bisülfit dönüşüm adımları arasında santrifüj kapasitesi ve akışı aracılığıyla atın. 200 µL Desulphonation arabelleği sütun ekleyerek Desulphonate örnekleri. 15-20 dk. tekrar Santrifüjü için oda sıcaklığında kuluçkaya ve akışı aracılığıyla atın. Yıkama arabelleği 200 µL sütunlarla iki kez yıkayın. Her örnek için oda sıcaklığında 3 dk kuluçka ve centrifuging sütun için (15.000 x g, 1 dk) 10 µL elüsyon arabelleği ekleyerek elute. Toplamda 20 µL elüsyon adımı yineleyin. PCR reaksiyon Master Mix 1 buzda hazırlayın. 82 µL karışımı her örnek için ekleyin. Aşağıdaki programı ile termal cycler kuluçkaya.PCR reaksiyon Master Mix 1 (örnek) başına:Su 30 µLMetil-Seq PCR Master Mix 50 µLMetil-Seq PCR1 astar F 1 µLMetil-Seq PCR1 astar R 1 µLTermal Cycler Program:Sahne 1, 1 döngüsü: 95 ° C 2 dkAşama 2, 8 devir: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 sSahne 3, 1 döngüsü: 72 ° C 7 dkEvre 4, 1 döngüsü: 4 ° C tutun 180 µL DNA’ya bağlanıcı manyetik boncuklar ve taze hazırlanmış % 70 etanol örnek başına 400 µL kullanarak örnekleri arındırmak. Her örnek için 180 µL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve Pelet % 70 etanol 200 µL içinde resuspend. Etanol kaldırmak ve yıkama bir kez yinelenir. Manyetik bir tabak boncuk cips ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Kuru bir 37 ° C olarak heatblock 3-5 dk kadar boncuk Pelet tamamen kuru. Nükleaz ücretsiz su 21 µL içinde resuspend ve yaklaşık 19.5 µL süpernatant ile toplamak. Dizin oluşturma PCR reaksiyon Master Mix 2 buz üzerinde hazırlamak. 25,5 µL ekleme Master Mix 2 her örnek için. 5 µL astar bireysel örnekleri için dizin oluşturma ticari ekleyin ve bir termal cycler kuluçkaya.PCR reaksiyon Master Mix 2 (örnek) başına:25 µL metil-Seq PCR Master Mix0.5 µL metil-Seq ortak dizin oluşturma astarTermal Cycler Program:Sahne 1, 1 döngüsü: 95 ° C 2 dkAşama 2, 6 döngüsü: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 sSahne 3, 1 döngüsü: 72 ° C 7 dkEvre 4, 1 döngüsü: 4 ° C tutunNot: Ek döngü (2-3) başlangıç DNA toplama önerilen değerler ise gerekli olabilir. 90 µL DNA’ya bağlanıcı manyetik boncuklar ve taze hazırlanmış % 70 etanol örnek başına 400 µL kullanarak örnekleri arındırmak. Her örnek için 90 µL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Boncuk cips, süpernatant kaldırmak ve Pelet % 70 etanol 200 µL içinde resuspend. Etanol kaldırmak ve yıkama bir kez yinelenir. Manyetik bir tabak boncuk cips ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Kuru bir 37 ° C olarak heatblock 3-5 dk kadar boncuk Pelet tamamen kuru. Nükleaz ücretsiz su 24 µL içinde resuspend ve yaklaşık 24 µL süpernatant ile toplamak. Konsantrasyon ve bp boyutu üzerinde bir bioanalyzer yüksek-duyarlı DNA algılama reaktifler kullanarak değerlendirmek.Not: Kütüphane DNA olup olmadığını belirlemek bioanalyzer başarısız olursa, ek DNA ile hazırlık adımları yineleyin.Nokta durdurma: arıtma sonra Dizin oluşturulmuş örnekleri olabilir mühürlü ve -20 ° C’de depolanan Örnekler uygun yeni nesil sıralama platformu için kullanılan havuz. DNA derişim Kütüphane boyutu ve miktarı verilen birime göre belirler, bioanalyzer, konsantrasyon verileri kullanarak düşük TE arabellek (6.1.1.1) ile sulandırmak ve 15 son bir konsantrasyon için tüm örneklerini birleştirmek pM.Not: Kütüphane miktarının bir daha duyarlı ve birleştirilmiş bağdaştırıcıları hedef primerler kullanılarak nicel gerçek zamanlı PCR tarafından yöntemdir. Havuza alınan örnekleri yeni nesil sekanslama Lane’de başına 4 örnek için yeterli şerit sayısı çalıştırın.Not: 16 kitaplık örnekleri benzersiz dizine ve kombine varsa, örneğin, üzerinde 4 şeritli, eşdeğer 4 örnek lane / kütüphaneler çalıştırın. 7. yeni nesil sekanslama üzerinde sıralama Bir yeni nesil sıralama makine üzerinde sıralama tarafından takip metil-Seq Kütüphane, kümeleme için kurumsal sıralama çekirdek örnekleri gönderin. 8. DMRs belirlemek için çözümlemesi Bismark15bisülfit dönüştürülür, artı-strand genom ham giriş okuyan hizalamak için bir iç sıra aligner16,17olarak, papyon 2.0 çağırır, uygulamak. Hizalama, Bismark_methylation_extractor kalite kontrol gerçekleştirmek ve her CpG bir tahmini metilasyonu değeri atamak için kullanın. DMRs bir listesini BS-Seq paket18 ile Bioconductor içinde oluşturun. Filtre DMRs temel 3 ardışık CpGs ve P-değeri büyük olan < 0,05.Not: genomik koordinatları, en yakın RefSeq gen Uzaklik, CpGs içinde her DMR, ortalama % CpG metilasyonu değeri arasında iki karşılaştırma grupları (vs vurgusuz vurguladımesela ), P-değeri, DMR sayısını içeren bir DMR listesi oluşturmak ve FDR (yanlış bulma oranı) değeri. DMR listesini, i.ekullanın., pyrosequencing astar doğrulama için tasarlamak için genomik koordinatları. 9. bisülfit Pyrosequencing doğrulanması Astar tasarım Tasarım bisülfit PCR için astar ve pyrosequencing. İç içe geçmiş PCR bir DMR 150-400 bps yükseltmek PCR astar (dış ve iç içe geçmiş) iki kümesi tasarlayın.Not: genel olarak, tasarlanmış astar en az 24 üsleri vardır. uzun en az 4-5 ardışık olmayan G’nin (C ters astar için) ile hesabınıza sıra karmaşıklığı kaybı sıcaklığından tavlama azaltılmış. Bir iç içe geçmiş astar biotin etiketli ve HPLC saf olacak. Ancak, standart astar ilk tepkiler üzerinde bir özel jel çözülerek PCR adım optimize etmek için sipariş. Pyrosequencing tahlil astar tamamlayıcı biotinylated hedefleyen böylece tasarım yolda sadece 1-2 üsleri akıntıya karşı denetlesinler için CpGs. Her pyrosequencing astar güvenilir 30 bps aşağı tahlil gibi birden çok pyrosequencing astar gerektiği şekilde tasarlayın. Rt1-m4 için aşağıdakileri kullanın:rRT1M4 dışında-F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAATrRT1M4 dışında-R AACTTACAAATTTCACCAACTCArRT1M4 Nested-F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAGrRT1M4 Nested-R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTArRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGATrRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAGrRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGATrRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT Piyasada bulunan bir kit fare kan gDNA bisülfit dönüşüm için kullanın.Not: Aşağıdaki değişiklikler ile piyasada bulunan kitinden bisülfit dönüşüm adımları uyarlanmıştır: adım 1, kan gDNA 50-100 ng ekleyin ve 20 µL su ile oranında seyreltin. 9. adımda örnek başına 20 µL elute. Bisülfit dönüşüm reaktif üreticinin protokolüne göre hazırlamak ve sulandırılmış gDNA ile birleştirir. Termal cycler (2,5 h, 4 ° C tutun 64 ° C) kuluçkaya. Bağlama arabellek dönüştürülmüş gDNA spin sütunlarda ve santrifüj (15.000 x g, 1 dk) ekleyin. Yıkama sütunları bir kez daha sonra Desulphonation arabellek için sütunları ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Santrifüj (15.000 x g, 1 dk.). Sütun yıkama tamponu ve santrifüj (15.000 x g, 1 dk) ile yıkayın. Santrifüjü (15.000 x g, 2 dk) ile yıkama adımı yineleyin. 20 µL eklemek elüsyon tampon ve santrifüj (15.000 x g, 1 dk) elute. PCR güçlendirme Dış PCR Master Mix hazırlayın. 3.5 µL bisülfit dönüştürülmüş gDNA için Master Mix 21,5 µL ekleyin ve termal cycler programını çalıştırın.Dış PCR Master Mix:Su 16.25 µLPolimeraz arabelleği 2.5 µL [10 x]0.5 µL dNTP [10 mM]İleri astar 1 µL [0,1 µM]Ters astar 1 µL [0,1 µM]Taq DNA polimeraz 0,25 µL [5000 U/mL].Termal cycler programı:Sahne 1, 1 döngüsü: 94 ° C 4 dkAşama 2, 47 devir: 94 ° C 1 dakika, 53 ° C 30 s, 72 ° C 1 dkSahne 3, 1 döngüsü: 72 ° C 8 dk, 4 ° C tutun İç içe geçmiş PCR Master Mix hazırlayın. Master Mix 23 µL örnek 2 µL için dış PCR ekleyin ve dış PCR termal cycler programı yineleyin. PCR ürün kalitesi jel elektroforez (1 x TAE arabellek, % 1’özel jel) aracılığıyla değerlendirmek.İç içe geçmiş PCR Master Mix:Su 17,75 µLPolimeraz arabelleği 2.5 µL [10 x]0.5 µL dNTP [10 mM]İleri astar 1 µL [0,1 µM]Ters astar 1 µL [0,1 µM]Taq DNA polimeraz 0,25 µL [5000 U/mL]Not: iç içe geçmiş PCR için ileri veya geriye doğru astar biotinylated olması gerekir. Pyrosequencing 38 µL bağlama arabellek, su 35 µL ve streptavidin kaplı sepharose boncuk örnek başına 2 µL içeren bir ana karışım yapmak. Bir 96-şey tabak içinde 75 µL ana mix ve iç içe geçmiş PCR ürününün 5 µL ekleyin. 15-60 dakika için bir plaka shaker sallamayın. Sallayarak süre, astar (0.5 µM, seyreltilmiş yılında TAV arabellek) 12 µL pyrosequencing tahlil plaka kuyu ekleyin. Sallayarak sonra bağlama tepki yıkama arabellekleri kullanarak yıkama adımları gerçekleştirin. Çukur yer vakum aracında su sonra plaka örnekler toplamak. Vakum % 70 etanol, NaOH (0.2 M) ve Tris asetat arabellek (10 mM, pH 7,4) içeren yarı dolu kaplar aracında daldırın. HS tahlil plaka boncuk aktarmak için vakum aracında vakum ve yer bağlantısını kesin. 2 dk. 5 min için serin sonra pyro programına başlamak için izin ver plaka için 80 ° C’de kuluçkaya ve plaka ısı blokta yer.