ストレス曝露に伴うエピジェネティックな変化を識別するためにラット メチル Seq プラットフォーム

やガイドラインの遵守すべて関連する規制・制度、機関動物ケアとジョンズ ・ ホプキンス医学利用委員会などを含むすべての実験を行った。 1. 動物 4 週齢で男性思春期ラットを取得します。温度でポリカーボネート ラット ケージに動物の家-12 h、12 h 暗いサイクル 0600 h で光で発症した部屋の湿度制御を提供する水に自由にアクセスできる動物と。 輸送に伴うストレスを減らすために 1 週の順応するラットを許可します。ペア住宅分離ストレスを排除し、5 週齢、慢性的な変数を開始 (N = 16) 動物は、3 週間 (CVS) 療法を強調します。 2. 慢性変動応力 予測不可能なルーチンを維持する不規則な時に一度朝 (9-11) と午後 (1-15) に、CVS の養生法を管理します。一晩穏やかなストレッサーを組み込みます。「CVS 療法が含まれています: 1) 3 h 拘束シリンダー;2) 10 分泳ぐ;3) 3 h ケージ傾斜 4) 1 h 遅い振動プラットフォーム;・ 5) 1 h 4 ° C の冷たい部屋で。注: 一晩ストレス社会叢生 (ケージごと 5)、社会的孤立、濡らした寝具、食事制限、ライトにあります。ストレス療法の典型的な週単位のスケジュールは、表 1に提供されます。 3. 内分泌を試金します。 コルチコステロン (CORT) 尾血 (~ 50 mL) サンプリングを使用してのレベル収集、実験を通して週 2 回同時に (9) CVS 養生法を前に毎週の CVS の途中で一度ベースライン ホルモン レベル (0 日目) の確立を決定 (日4,11 と 18 日)、CVS のすべての 7 日後 (日 7、14)、CVS (21 日) の結論。毎日ストレス療法前に血液サンプルを収集します。 RIA とゲノム DNA の抽出の安楽死 (25 日) の間に 1 つの最終的なトランクの血液サンプルを収集します。 (600 x g、4 ° C, 10 分) 血液細胞から血漿を分離するすべての血液サンプルを遠心します。ピペット プラズマ (清) と試料-80 ° C で保存 解凍し、ラジオイムノアッセイ (RIA) が CORT のレベルを決定するため、プラズマを使用します。3 週間血中 CORT ストレス療法の堅牢性を確認するストレス動物の上昇しているを確認します。 4. 動作 CVS の養生法の後 (23-24 日)、高架上の不安様行動のそれぞれの動物を評価プラス (EPM)14の迷路。 300 s と時間、センターでスコア EPM 装置上の動物ビデオ カメラのレコードを使用して、腕を閉じるし、オープン腕を。 5. ラット メチル Seq のデザイン UCSC のゲノムのブラウザーを使用して、取得 CpG の島と島の海岸 (± 1 kb の CpG の島の側面)、各 RefSeq 遺伝子とから利用可能な他のシーケンスのプロモーター (± 各 TSS の 1 kb) の非冗長のゲノム座標 (ラットは rn4 アセンブリの 2004 年 11 月)関連する文献。注意: ラット メチル Seq の以前のアレイ ・ ベースのメチル化プラットフォームから追加の GC 豊富なシーケンスは12を追加されました。5 kbps を超える地域、スキップされた 1 kbps に続いて、500 bps の交互になる地域採取。230 万 Cpg; 111 Mbps から成っている最終的なラット メチル Seq デザイン594 bps の地域の平均サイズ。228,800 ユニークな軌跡を対象します。 市販ターゲット キャプチャ デザイン ソフトウェアに適切なプローブ デザインのゲノム座標のコンパイルされたリストを入力します。 6. Genomic DNA からラット メチル Seq ライブラリーの構築 注: バッチの効果を除去するために複数のサンプルを同時に処理し、それに応じてスケール マスター ミックス アップ。市販 DNA 抽出キットを使用して DNA を抽出します。高品質 DNA 収量カラムベースまたは沈殿法 (260/280 比 1.8 〜)。フェノール ベースのメソッドの使用は推奨されません。溶出または低 TE バッファー (10 mM テ、0.1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) で DNA を再懸濁します。 サンプル準備注: すべてのステップは DNA 結合の磁気ビーズを用いて、確認ビーズの少なくとも 30 分室温に慣れるし、使用前によく混合します。 DNA をせん断 各サンプルの初期の二重鎖 DNA の濃度を決定するため、蛍光光度計を使用します。希釈 > gDNA 低 TE バッファー (10 mM テ、0.1 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) 低 DNA 結合マイクロ遠心チューブ用の 50 μ L に 1 μ g。 等温超音波発生装置を使用してサンプルをせん断 (10% のデューティ サイクル、5 強度、バースト、60 s、周波数掃引、4 ° C の 6 サイクルあたり 200 サイクル)。 DNA のサイズと量を測定する電気泳動に基づくシステムを使用して DNA の品質を評価します。注: 推奨 DNA 量は 1 μ g または 3 μ g です。最低の入力量をする必要がありますが開始材料限られている場合、> 500 ng、低額に悪影響が生成ライブラリの質と量。 DNA 修復を終了します。 ラット メチル Seq キットを使用して、氷の上終わり修理マスター ミックスを調製します。各サンプルにミックスの 52 μ L を追加し、サーマルサイクラー温水ふた (20 ° C 30 分、4 ° C ホールド) なしで孵化させなさい。修理-終わりマスター ミックス (サンプルごと)。水の 35.2 μ L最後修理バッファーの 10 μ L (10 倍)DNTP ミックスの 1.6 μ LT4 DNA ポリメラーゼの 1 μ LKlenow DNA ポリメラーゼの 2 μ LT4 ポリヌクレオチド キナーゼの 2.2 μ L DNA 結合磁性体ビーズ 180 μ L と 1 サンプルあたり作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を使用してサンプルを浄化します。各サンプルにビーズの 180 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。ビーズをペレット、上清を除去、70% エタノール 200 μ L でペレットを再懸濁します。エタノールを削除し、一度洗浄を繰り返します。 磁気プレートを使用してビーズをペレットし、できるだけ多くのエタノールを削除します。37 ° C で乾燥 heatblock ビーズ ペレットが完全になるまで 3-5 分間乾燥させます。ヌクレアーゼ フリー水 44 μ で再懸濁します、上澄みの約 42 μ L を収集します。停止ポイント: DNA 修復が終了した後のサンプルがありますに密封され、-20 ° C で保存 アデニル酸 3′ を終了します。 氷上アデニル マスター ミックスを調製します。各サンプルに 9 μ L ミックスを追加し、サーマルサイクラー温水ふた (37 ° C 30 分、4 ° C ホールド) なしで孵化させなさい。アデニル マスター ミックス (サンプルごと):Klenow バッファーの 5 μ LDATP の 1 μ LKlenow DNA ポリメラーゼの 3 μ L DNA 結合磁性体ビーズ 90 μ L と 1 サンプルあたり作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を使用してサンプルを浄化します。各サンプルにビーズの 90 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。ビーズをペレット、上清を除去、70% エタノール 200 μ L でペレットを再懸濁します。エタノールを削除し、一度洗浄を繰り返します。 磁気プレートを使用してビーズをペレットし、できるだけ多くのエタノールを削除します。37 ° C で乾燥 heatblock ビーズ ペレットが完全になるまで 3-5 分間乾燥させます。ヌクレアーゼ フリー水の 35 μ L で再懸濁します清約 33.5 μ L を収集しています。 メチル化アダプターを縛る。 氷上結紮マスター ミックスを調製し、ミックスの 16.5 μ L を各サンプルに追加します。サーマルサイクラー (20 ° C、4 ° C ホールドの 15 分間) 加熱蓋なしで孵化させなさい。結紮マスター ミックス (サンプルごと):水の 2.5 μ L2.5 μ L メチル Seq のメチル化アダプターT4 DNA リガーゼ バッファーの 10 μ L (5 x)T4 DNA リガーゼの 1.5 μ L DNA 結合磁性体ビーズ 90 μ L と 1 サンプルあたり作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を使用してサンプルを浄化します。各サンプルにビーズの 90 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。ビーズをペレット、培養上清を削除および 70% のエタノールの 200 μ L でペレットを再懸濁します。エタノールを削除し、一度洗浄を繰り返します。 磁気プレートを使用してビーズをペレットし、できるだけ多くのエタノールを削除します。37 ° C で乾燥 heatblock ビーズ ペレットが完全になるまで 3-5 分間乾燥させます。ヌクレアーゼ フリー水の 22 μ L で再懸濁します、上澄みの約 22 μ L を収集します。バイオアナライザーを使用して品質を評価します。注: DNA の総容量は 500 未満 ng, せん断, およびプロセス追加 DNA 以降の手順に進む前に。30 bps 以上で平均 DNA サイズが増えない場合は、試薬の新しい、T4 DNA ポリメラーゼ、Klenow、または T4 リガーゼが古い可能性がありますを確認します。停止ポイント: メチル化アダプターを縛ること後のサンプルがありますに密封され、-20 ° C で保存 交配 低 DNA 結合マイクロ遠心チューブ用にサンプルを転送し、未満 3.4 μ L. 西川 3.4 μ L をサンプルにサンプル ボリュームを抑える加熱真空濃縮を使用します。注: 集中サンプルがすべて液体の前に真空濃縮から削除されることを確認する約 〜 3 μ L のサンプルを蒸発させます。 常温で氷の上のメチル Seq ブロック ミックス交配バッファーを準備します。各サンプルにメチル Seq ブロック ミックスの 5.6 μ L を追加し、サーマルサイクラー (95 ° C 65 ° C ホールド 2 分の 65 ° C 5 分) で孵化させなさい。交配バッファー (サンプルごと):6.63 メチル Seq Hyb 1 μ Lメチル Seq Hyb 2 0.27 μメチル Seq Hyb 3 の 2.65 μ Lメチル Seq Hyb 4 3.45 μメチル Seq ブロック ミックス (サンプルごと):メチル Seq インデックス ブロック 1 の 2.5 μ Lメチル Seq ブロック 2 の 2.5 μ Lメチル Seq ブロック 3 の 0.6 μ L RNase ブロック ミックスとキャプチャ ライブラリ交配の組合せを準備します。各サンプルにキャプチャ ライブラリ交配の組合せの 20 μ L を追加し、65 ° C 少なくとも 16 時間インキュベートします。RNase ブロック ミックス (サンプルごと):RNase ブロックの 0.5 μ L水の 1.5 μ L(サンプルごと) ライブラリ交配の組合せをキャプチャします。交配バッファーの 13 μ LRNase ブロック ミックスの 2 μ Lラット メチル Seq の 5 μ L をキャプチャ ライブラリ注: は、非特異的結合を防ぐために交配の組合せを追加する場合、 65 ° C で反応を続ける。 新しい 8 よくストリップ管にサンプルあたりストレプトアビジン磁気ビーズの分注 50 μ L。200 μ L メチル Seq 結合バッファーのビード洗浄しなさい。磁気プレートを使用して、ビーズをペレットし、3 洗浄の合計のための各洗浄の上清を除去します。最終的な洗浄の後に、メチル Seq 結合バッファーを 200 μ l 添加のストレプトアビジン ビーズを再懸濁します。 洗浄ストレプトアビジン磁気ビーズを 200 μ l 添加するサンプルを追加し、回転ミキサーを使用して 30 分間室温でインキュベートします。96 ウェル プレート サンプルと事前 65 ° C に温めてサーマルサイクラーの場所ごとの帳票の井戸にメチル Seq 洗浄バッファー 2 の因数の 200 μ L を混合しながら インキュベーション後、磁気板を用いたストレプトアビジン磁気ビーズをペレットし、ビーズを 200 μ L で再懸濁しますメチル Seq 洗浄バッファー 1。室温で 15 分間インキュベートします。ペレット、上澄みを廃棄し、磁気プレートを使用します。 ビード メチル Seq 洗浄バッファー 2 で 3 回洗浄しなさい: 洗浄バッファー 2 (手順 6.2.5 で予め加温) 200 μ L でビーズ ペレットを再懸濁します、サーマルサイクラー (65 ° C, 10 分) のビーズをインキュベートし、ビーズをペレットします。磁気プレートを使用して各洗浄後上澄みを廃棄します。注: は、非特異的結合を防ぐために洗浄バッファー 2 を追加する際に交配反応 65 ° c を維持します。 洗浄のビーズにメチル Seq 溶出バッファーの 20 μ L を追加し、20 分使用ペレット ビーズと新しいストリップ チューブに上清転送磁気プレートは室温で孵化させなさい。ビーズを破棄します。注: 抱卵中の重亜硫酸塩の変換試薬を準備します。 重亜硫酸塩の変換注: 適切な試薬と市販の重亜硫酸塩の変換キットからの指示を使用して溶出 ssDNA の重亜硫酸塩の変換を実行します。 前の手順から、上澄みに 130 μ L 準備重亜硫酸塩の変換試薬を追加します。2 つの井戸に均等に 150 μ L 反応のそれぞれに分割します。サーマルサイクラー (2.5 h、4 ° C ホールドの 64 ° C) で孵化させなさい。注: 150 μ L 反応は、均質な温度を確保するため 2 つの井戸に均等に分かれています。2.5 h をインキュベートした後すぐに次のステップに進みます。 バッファーのバインドの 600 μ L を追加することによって列をスピン洗浄バッファーの 100 μ L で 1 回洗浄しサンプルをバインドします。遠心分離機 (15,000 × g、1 分) の列のすべての重亜硫酸塩の変換手順の間、流れを破棄します。 Desulphonation バッファーの 200 μ L を列に追加することによって Desulphonate のサンプル。15-20 分繰り返し遠心室温でインキュベートし、流れを破棄します。 200 μ L の洗浄バッファーで 2 回列を洗います。10 μ L の溶出バッファーを列、室温で 3 分間インキュベートし、遠心分離 (15,000 × g、1 分) に追加することによって各サンプルを溶出します。20 μ L の合計のため溶出のステップを繰り返します。 PCR 反応氷の上のマスター ミックス 1 を準備します。ミックスの 82 μ L を各サンプルに追加します。次のプログラムでサーマルサイクラーで孵化させなさい。PCR 反応マスター ミックス 1 (サンプルごと):水の 30 μ Lメチル Seq PCR マスター ミックスの 50 μ Lメチル Seq PCR1 プライマー F の 1 μ Lメチル Seq PCR1 プライマー R の 1 μ Lサーマルサイクラー プログラム:ステージ 1、1 サイクル: 95 ° C 2 分ステージ 2、8 サイクル: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 sステージ 3、1 サイクル: 72 ° C 7 分ステージ 4、1 サイクル: 4 ° C ホールド DNA 結合磁性体ビーズ 180 μ L と 1 サンプルあたり作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を使用してサンプルを浄化します。各サンプルにビーズの 180 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。ビーズをペレット、上清を除去、70% エタノール 200 μ L でペレットを再懸濁します。エタノールを削除し、一度洗浄を繰り返します。 磁気プレートを使用してビーズをペレットし、できるだけ多くのエタノールを削除します。37 ° C で乾燥 heatblock ビーズ ペレットが完全になるまで 3-5 分間乾燥させます。ヌクレアーゼ フリー水の 21 μ L で再懸濁します、上澄みの約 19.5 μ L を収集します。 インデックスの作成 反応 PCR マスター ミックス 2 氷の上を準備します。25.5 μ L を追加する各サンプルのマスター ミックス 2。個々 のサンプルにプライマーをインデックス商業 5 μ l 添加し熱 cycler で孵化させなさい。PCR 反応マスター ミックス 2 (サンプルごと):25 μ L メチル Seq PCR マスター ミックス0.5 μ L メチル Seq 共通インデックス プライマーサーマルサイクラー プログラム:ステージ 1、1 サイクル: 95 ° C 2 分ステージ 2、6 サイクル: 95 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C 30 sステージ 3、1 サイクル: 72 ° C 7 分ステージ 4、1 サイクル: 4 ° C ホールド注: 追加サイクル (2-3) 開始の DNA 濃度が推奨値未満の場合は必要があります。 DNA 結合磁性体ビーズ 90 μ L と 1 サンプルあたり作りたての 70% のエタノールの 400 μ L を使用してサンプルを浄化します。各サンプルにビーズの 90 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。ビーズをペレット、上清を除去、70% エタノール 200 μ L でペレットを再懸濁します。エタノールを削除し、一度洗浄を繰り返します。 磁気プレートを使用してビーズをペレットし、できるだけ多くのエタノールを削除します。37 ° C で乾燥 heatblock ビーズ ペレットが完全になるまで 3-5 分間乾燥させます。ヌクレアーゼ フリー水の 24 μ L で再懸濁します、上澄みの約 24 μ L を収集します。 濃度と bp のサイズ、バイオアナライザーに高感度 DNA 検出試薬を使用して評価します。メモ: バイオアナライザー DNA ライブラリの存在を検出する場合は、追加の DNA の準備の手順を繰り返します。停止点: 浄化後インデックス付きサンプル密封可能性があり、-20 ° C で保存 使用する適切な次世代シーケンシング プラットフォームのサンプルのプール。 ライブラリのサイズと指定されたボリュームの数量に基づいて DNA モル濃度を決定するバイオアナライザー濃度データを用いて低 TE バッファー (6.1.1.1) と希釈し、15 の最終的な集中にすべてのサンプルを組み合わせた午後。注: ライブラリを定量化のより敏感な方法は、結紮アダプターを対象とするプライマーを使用して量的なリアルタイム PCR です。 次世代シーケンサーのレーンあたり 4 サンプルの十分な車線数にプールされたサンプルを実行します。注: たとえば場合 16 ライブラリのサンプルは一意にインデックスを作成し、結合、実行ライブラリ以上 4 車線、車線あたりのサンプル数 4 に相当。 7. 次世代シーケンサーのシーケンス 次世代シークエンシング マシンでシーケンスが続くメチル Seq ライブラリのクラスタ リングの制度的シーケンス コアにサンプルを送信します。 8. Dmr を識別する分析 ビスマルク15、亜硫酸水素変換、プラス鎖のゲノムを生入力読み取りを合わせて、内部シーケンス アライナ16,17、ボウタイ 2.0 を起動するを実装します。次の配置、品質管理を行い、各 CpG メチル化推定値を代入する、Bismark_methylation_extractor を使用します。 Bioconductor で BS Seq パッケージ18 Dmr のリストを生成します。フィルター、Dmr が 3 連続した Cpg と P 値よりも大きいことに基づいて < 0.05。注: ゲノム座標、最寄りの RefSeq 遺伝子までの距離、それぞれの DMR、平均 %cpg メチル化値 P 値 (例えば、強勢と強調)、2 つの比較のグループ DMR を内の Cpg の数が含まれています DMR リストを生成し、FDR (虚偽の発見率) の値。すなわちDMR リストを使用します。、検証パイロシークエンス プライマーを設計するためのゲノム座標。 9. 重亜硫酸塩ピロシーケンスによる検証 プライマー デザイン 重亜硫酸塩 PCR のためのプライマーおよびパイロシークエンス設計します。Nested pcr 法は、DMR の 150-400 bps を増幅するように (外と入れ子になった)、PCR のプライマーの 2 つのセットをデザインします。注: 一般に、設計されたプライマーは少なくとも 24 拠点のアニール温度シーケンスの複雑さの損失からアカウントに少なくとも 4-5 連続しない G の (C の逆プライマー) と長い。ビオチン標識し、HPLC 精製入り込まれたプライマーの 1 つになります。ただし、標準的なプライマーは agarose のゲルの反応を解決することによって PCR のステップを最適化する最初を注文する必要があります。 デザイン、パイロシークエンス プライマーをアッセイは、相補的なビオチンを対象はちょうど 1-2 塩基上流に試金する Cpg の鎖します。各パイロシークエンス プライマー 30 bps 下流を分析することが確実に、必要に応じて複数パイロシークエンス プライマーを設計します。 Rt1-m4 は、次を使用します。外 – F TGTAYGATTTTGGTTATYGTAAAT rRT1M4外-R AACTTACAAATTTCACCAACTCA rRT1M4rRT1M4 ネスト-F GTGGGTTAYGTGGATAATATATAGrRT1M4 ネスト-R AATCACTTACCATTCTCTCTCTAACTArRT1M4 Pyro1 TAYGTGGATAATATATAGATrRT1M4 Pyro2 GATAGTTATTTGGYGAGTTAGrRT1M4 Pyro3 GAGTATTTGGAGGAGTTGATrRT1M4 Pyro4 GGATTTTAATATTTGGT ラット血液 gDNA の重亜硫酸塩の変換のため、市販のキットを使用します。注: 重亜硫酸塩の変換の手順は、次の変更と市販キットから適応されている: ステップ 1 で、50-100 ng の血 gDNA を追加し、20 μ L を水で希釈します。ステップ 9 でサンプルごとの 20 μ L を溶出します。 重亜硫酸塩の変換試薬製造元のプロトコルに従ってを準備し、希釈された gDNA を組み合わせます。サーマルサイクラー (2.5 h、4 ° C ホールドの 64 ° C) で孵化させなさい。 スピン列および遠心分離機 (15,000 × g, 1 分) で変換された gDNA をバッファーのバインドを追加します。洗浄列は、一度 Desulphonation バッファーを列に追加し、室温で 15 分間インキュベートします。遠心分離機 (15,000 × g、1 分)。 洗浄バッファーと遠心分離機 (15,000 × g、1 分) 列を洗います。遠心分離 (15,000 × g、2 分) と洗浄手順を繰り返します。20 μ l 添加溶出バッファーと遠心分離機 (15,000 × g、1 分) が溶出します。 PCR の拡大 外の PCR マスター ミックスを準備します。3.5 μ L の重亜硫酸塩の変換された gDNA をマスター ミックスの 21.5 μ L を追加し、サーマルサイクラー プログラムを実行します。外 PCR マスター ミックス:水の 16.25 μ Lポリメラーゼ バッファーの 2.5 μ L [10 x]DNTP [10 mM] の 0.5 μ L前方のプライマーの 1 μ L [0.1 μ M]逆のプライマーの 1 μ L [0.1 μ M]Taq DNA ポリメラーゼの 0.25 μ L [5000 U/mL]。サーマルサイクラー プログラム:ステージ 1、1 サイクル: 94 ° C 4 分ステージ 2、47 サイクル: 94 ° C 1 分、53 ° C 30 s 72 ° C 1 分ステージ 3、1 サイクル: 72 ° C 8 分、4 ° C ホールド ネステッド PCR マスター ミックスを準備します。外の PCR から 2 μ L のサンプルをマスター ミックスの 23 μ l 添加し PCR サーマルサイクラーの外部プログラムを繰り返します。(1 x TAE バッファー、1% の agarose のゲル) のゲル電気泳動による PCR の製品の品質を評価します。ネステッド PCR マスター ミックス:水の 17.75 μ Lポリメラーゼ バッファーの 2.5 μ L [10 x]DNTP [10 mM] の 0.5 μ L前方のプライマーの 1 μ L [0.1 μ M]逆のプライマーの 1 μ L [0.1 μ M]Taq DNA ポリメラーゼの 0.25 μ L [5000 U/mL]注: ネストされた PCR のため順方向または逆プライマーでなければならないビオチン化 パイロシークエンス バッファーのバインドの 38 μ L、水の 35 μ L および 2 μ L のサンプルあたりストレプトアビジン コーティング セファローズ 4 b ビーズを含むマスター ミックスを作る。96 ウェル プレートでのマスターの組合せの 75 μ L とネストされた PCR の製品の 5 μ L を追加します。15-60 分間プレート シェーカーを振る。 揺れながらパイロシークエンス アッセイ プレートのウェルにプライマー (0.5 μ M で希釈アニーリング バッファー) の 12 μ L を追加します。 後揺れ、結合反応洗浄バッファーを使用して洗浄手順を実行します。水で満たされた谷で真空ツールを配置し、板からサンプルを収集します。70% エタノール、水酸化ナトリウム (0.2 M)、トリス酢酸緩衝液 (10 mM、pH 7.4) を含む半分満たされた谷で真空ツールが水没します。ビーズを転送する HS アッセイ プレートの真空と場所真空ツールから外します。 ヒート ブロックにプレートを置き、2 分 5 分間冷却し、パイロ プログラムを開始許可プレートの 80 ° C で孵化させなさい。