هنا، يمكننا وصف البروتوكول وتنفيذ الميثيل-Seq، منصة ابيجينوميك، باستخدام نموذج الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد المزمن. النتائج تبين أن منصة Seq الميثيل الفئران قادرة على اكتشاف الاختلافات مثلايشن التي تنشأ من التعرض للإجهاد في الفئران.
كلما توفرت مورثات من طائفة متنوعة من الحيوانات، هناك حاجة متزايدة للأدوات التي يمكن التقاط دينامية تغييرات جينية في هذه النماذج الحيوانية. الفأر هو الحيوان نموذج معين واحد حيث أداة جينية يمكن أن تكمل العديد من الدراسات الدوائية والسلوكية لتوفير المعلومات آليا الثاقبة. وتحقيقا لهذه الغاية، علينا تكييف “نظام التقاط الهدف سوريسيليكت” (المشار إليها ك Seq الميثيل) للفئران، التي يمكن تقييم مستويات مثلايشن الحمض النووي عبر جينوم الفئران. واستهدفت تصميم الفئران المروجين والبد جزر وشواطئ الجزيرة والمناطق الغنية GC من جميع ريفسيق الجينات.
لتنفيذ منهاج العمل في تجربة الفئران، الفئران “سبراغ داولي” الذكور يتعرضون للإجهاد المزمن المتغير لمدة 3 أسابيع، بعد ذلك تم جمع عينات الدم لاستخراج الحمض النووي الجينوم. وشيدت المكتبات Seq الميثيل من عينات الحمض النووي الفئران بالقص وربط محول وإثراء الهدف، بيكبريتيت التحويل والإرسال المتعدد. المكتبات كانت متسلسلة على منصة الجيل التالي تسلسل وحللت ما يلي تسلسل زمني لتحديد DMRs بين الحمض النووي فئران أكد وبهيج. DMRs المرشح العلوي كانت تؤيدها بشكل مستقل بيكبريتيت بيروسيكوينسينج للتأكد من متانة النظام الأساسي.
النتائج تبين بأن منهاج Seq الميثيل الفئران أداة جينية مفيدة يمكن التقاط مثلايشن التغييرات الناجمة عن التعرض التأكيد.
السلف في التسلسل الفائق أدت إلى ثروة تسلسل الجينوم للنموذج والكائنات الحية غير نموذجية. وسهلت توافر هذه التسلسلات البحوث في علم الوراثة وعلم الجينوم المقارن، وترانسكريبتوميكس. على سبيل المثال، تسلسل الجينوم المتوفرة مفيدة للغاية لمحاذاة البيانات تسلسل من تجارب Seq رقاقة التي تثري الحمض النووي استناداً إلى ارتباطه مع هستون التعديلات1، أو تسلسل بيكبريتيت، الذي يقيس مثلايشن الحمض النووي قبل اكتشاف اليوراسيل تكونت من تحويل بيكبريتيت سيتوسينيس أونميثيلاتيد2. ومع ذلك، كانت هناك تأخيرات في تنفيذ مناهج ابيجينوميك التي تتضمن بيانات تسلسل الجينوم متاحة في تصميمها بسبب الافتقار إلى البيانات المشروح لإبلاغها متواليات التنظيمية التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الجينات.
على وجه الخصوص، مثلايشن الحمض النووي هو واحد من تعديلات جينية درس على نطاق واسع في الحمض النووي التي يمكن الاستفادة من البيانات الجينية المتاحة لبناء منصة ميثيلوميك. واحد هذه الأمثلة هو منصة المستندة إلى الصفيف مثيلوم البشرية3، التي تستخدم على نطاق واسع في مختلف التخصصات من الأورام للطب النفسي4،5. ولسوء الحظ، منصات مشابهة لنماذج حيوانية غير البشرية نادرة، كما أن هناك تقريبا لا تستخدم على نطاق واسع المنصات التي استفادت من تسلسل الجينوم في تصميمها الأولى.
أسلوب شائع لتقييم المناظر الطبيعية ميثيلوميك من نماذج حيوانية غير البشرية انخفاض تمثيل بيكبريتيت التسلسل (رربس)6. وهذا النهج ويتغلب على تكلفة تسلسل بيكبريتيت الجينوم كل ذلك، بينما توفر المناظر الطبيعية ميثيلوميك شامل، يوفر تغطية القراءة-عمق أقل بسبب التكلفة ومحدودية المعلومات الفنية في المناطق الفقيرة بالجينات الكبيرة الجينوم2 . رربس ينطوي على خلاصة القيد واختيار حجم من الحمض النووي لإثراء للغاية الغنية GC متواليات مثل جزر البد التي وجدت بالقرب من مروجي الجينات ويعتقد أن تلعب دوراً في تنظيم الجينات7عادة. في حين قد استخدمت الأسلوب رربس في عدد من الدراسات الهامة، إلى الاعتماد على إنزيمات التقييد لا يخلو أبرز التحديات والقيود. على سبيل المثال، إثراء لتسلسل GC الغنية في رربس اعتماداً كلياً على وجود تسلسل معين المعترف بها من قبل إنزيم تقييد التحديد حجم اللاحقة بالتفريد. وهذا يعني استبعاد أي مناطق الجينوم التي لا تحتوي على هذه المواقع تقييد أثناء اختيار الحجم. أيضا، تشكل تحديا مقارنات عبر الأنواع إلا إذا كان نفس المواقع بتقييد موجودة في المكان نفسه فيما بين الأنواع المختلفة.
نهج واحد للتغلب على القيود المفروضة على رربس هو استخدام أسلوب إثراء الذي يستفيد من تسلسل الجينوم المنشورة في تصميم منهاج العمل. يستخدم المنهاج البشري القائم على صفيف التمهيدي المسابر المصممة ضد المعبأة معينة محددة اليل (CG مقابل تيراغرام بعد التحويل بيكبريتيت) هدف التمديد الصلب والتمهيدي. ويعكس تصميمها ليس فقط المتاحة تسلسل الجينوم البشري، ولكن التحقق منها تجريبيا المناطق التنظيمية المكتسبة من عدة أسطر من التحقيق، مثل ترميز وانسيمبل8. على الرغم من استخدامه على نطاق واسع في التحقيقات ميثيلوميك البشرية، لا توجد منصة مماثلة للحيوانات النموذجية. وباﻹضافة إلى ذلك، تنسيق المستندة إلى صفيف يضع قيد كبير على مساحة السطح المتوفرة لموضع التحقيق. في السنوات العديدة الماضية، بذلت جهود الجمع بين الهدف-خصوصية تتيحها تصميم المسبار الالتقاط والميزة الفائق من الجيل التالي التسلسل. مسعى من هذا القبيل قد أدى نظام الإثراء المستهدف على أساس تسلسل الجينوم الماوس (الماوس Seq الميثيل)، الذي كان يستخدم لتحديد الاختلافات الخاصة بالدماغ أو بفعل جلوكوكورتيكويد في مثلايشن9،10. منصات مشابهة لنموذج ونموذج غير الحيوانات الأخرى ضرورية لتيسير البحوث ابيجينوميك في هذه الحيوانات.
هنا، علينا أن نظهر تنفيذ منهاج هذه الرواية إجراء تحليل ميثيلوميك في الفئران. الفئران بمثابة نموذج حيوانية هامة في علم الصيدلة، والايض، ونيوروندوكرينولوجي، والسلوك. على سبيل المثال، هناك حاجة متزايدة لفهم الآليات الكامنة التي تؤدي إلى سمية العقاقير، والسمنة، وإجهاد استجابة، أو الإدمان على المخدرات. منصة الفائق قادرة على التقاط التغييرات ميثيلوميك المرتبطة بهذه الشروط ستزيد من فهمنا للآليات. حيث لا يزال يفتقر جينوم الفئران إلى الشرح للمناطق التنظيمية، أدرجت المروجين غير زائدة، جزر البد، وشواطئ الجزيرة11، وسبق تحديد التسلسلات GC الغنية في الفئران Seq الميثيل منهاج12.
لتقييم النجاح في تصميم وتنفيذ برنامج “تخصيب الهدف سوريسيليكت” (يشار إليها عموما Seq الميثيل) لجينوم الفئران، استخدمنا نموذج الفئران ل الإجهاد المزمن متغير (السير الذاتية)13 تحديد الأثران ميثليته المناطق بين الحيوانات بهيج وأكد. لدينا تصميم منصة والبروتوكول، والتنفيذ قد يكون مفيداً للمحققين الذين قد يرغبون في إجراء تحقيقات شاملة وغير متحيزة جينية في الكائن حي الذي تسلسل الجينوم متاحة بالفعل، لكنها لا تزال سيئة المشروح.
في هذه الدراسة، ونحن تصميم وتنفيذ منهاج الميثيل-تسلسل جينوم الفئران. بإظهار فائدتها مع نموذج الفئران من الإجهاد، أثبتنا أن خط الأنابيب التجريبية والتحليلية يمكن أن توفر مناطق ميثليته متفاوتاً بين المجموعتين المقارنة.
لضمان تنفيذ ناجح لمنهاج العمل، بحاجة إلى العديد من الخطوات الهامة التي يتعين مراعاتها. أولاً، الأولى من الحمض النووي نوعية وكمية أثرا كبيرا على نوعية وكمية من المكتبة Seq الميثيل النهائي. كنا فلوروميتير، بدلاً من جهاز المطياف الضوئي، لضمان أن يعكس قياس الحمض النووي لدينا كمية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الحالية. بيواناليزير استخدمت لقياس حجم الجزيئي وكمية من الحمض النووي بعد القص وبعد ربط محول. التحقق من حجم الجزيئي “التحول” بين هذه الخطوات أمر حاسم لتأكيد وجود محولات في نهاية كل جزء من الحمض النووي التي ستخضع لمحول بوساطة PCR في الخطوات اللاحقة. كمية الحمض المتبقي في نهاية هذه الخطوة ربط محول مهم أيضا، منذ مالا يقل عن 100 نانوغرام المنتج مكتبة مطلوب في هذه الخطوة لضمان توفر كمية كافية بعد هدف الإثراء وبيكبريتيت خطوات التحويل. أجرى قياس حساسية عالية نهائي على المكتبة Seq الميثيل شيدت حتى أن المكتبة يمكن أن تضعف بشكل صحيح للمجموعات اللاحقة على التسلسل الجيل القادم. أخيرا، كان يعمل بيروسيكوينسينج بيكبريتيت كأسلوب كمي عالية ومستقلة تقييم مدى دقة خط الأنابيب التحليلية. المصادقة النهائية على استخدام عينات الأصلي والنسخ المتماثل باستخدام الحيوانات إضافية خطوات حاسمة لضمان أن هذه التجربة يمكن الكشف عن تغيرات هامة بيولوجيا في مثلايشن الحمض النووي.
نحن تشمل أيضا العديد من المبادئ التوجيهية في حالة الانحراف عن البروتوكول، أو إذا كانت تواجه مشاكل. أولاً، من الممكن أن تفقد الكثير من الحمض النووي خلال نهاية الإصلاح أو ربط محول خطوات تنقية حبة المغناطيسية. وبدلاً من ذلك، بدأت كميات من الحمض النووي يمكن أن تكون صغيرة (< 200 نانوغرام) نظراً لتوافر محدود الأنسجة/الحمض النووي أو تنفيذ مختلف أساليب الإثراء مثل الأسفار تنشيط الخلية الفرز. زيادة عدد دورة خلال الخطوات التضخيم مكتبة اثنين قد تكون قادرة على تعويض عن خسارة المفرط للحمض النووي أو منخفضة ابتداء من كمية الحمض النووي في جميع أنحاء البروتوكول بناء المكتبة. ومع ذلك، لا أكثر من إضافية 2 – 3 دورات يوصي، التضخيم المفرط قالب من المرجح أن تؤدي إلى زيادة في عدد القراءات مكررة يجري التسلسل. وتستبعد هذه التكرارات أثناء الخطوة المحاذاة للحيلولة دون تحيز في المئة مثلايشن العمليات الحسابية. ثانيا، إذا كان متوسط حجم الحمض النووي لا يزيد بأكثر من 30 bps، تحقق للتأكد من أن الكواشف جديدة، بوليميراز الدنا T4، كلينوو، و/أو T4 ليجاسى قد تكون قديمة. ويمكن استخدام الكواشف استبدال المتاحة تجارياً.
بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن DMRs المتوقعة قد لا التحقق من صحة بيروسيكوينسينج، حيث لا توجد الاختلافات مثلايشن الحمض النووي أو هي أقل بكثير من تلك التي تنبأ بها التحليل. التحقق من صحة الفقراء من المناطق المرشحة مشكلة شائعة جداً للعديد من التحليلات على نطاق الجينوم، مثل عندما لم تؤكد النتائج بيروسيكوينسينج مثلايشن التفاضلية أو حجم التأثير أصغر بكثير من التي تنبأ بها التحليل. بسموث حزمة واحدة التحليلية أن “ينعم” مستويات مثلايشن عبر نافذة المعبأة متعددة. للتجربة الحالية، تورط بسموث مستويات مثلايشن التي كانت تؤيدها بيروسيكوينسينج بيكبريتيت هيئة الهجرة واللاجئين. ومع ذلك، سيكون هناك يرجح أن التباين بين المستويات مثلايشن التي تنبأ بها بسموث، وتلك التي يتم التحقق من بيروسيكوينسينج. الاختلافات تنشأ من تجانس الدالة التي تقدر القيم مثلايشن المتوسط عبر جميع المعبأة داخل هيئة الهجرة واللاجئين، بما في ذلك على التوالي المعبأة التي قد تختلف في مثلايشن الحمض النووي بأكثر من 50% أو المعبأة قيمها مثلايشن استبعدت نظراً العتبة الفرعية قراءة متعمقة. R-مجموعات مثل ميثيلكيت24 يمكن استخدامها لتحديد أصغر ويندوز المعبأة أو المعبأة واحد حتى مستويات مثلايشن التي ترتبط بشدة بتلك التي يصادق عليها بيروسيكوينسينج. وسيكفل تنفيذ حزم مختلفة واختبار تلك المناطق المتوقعة أو المعبأة من مثلايشن التفاضلية التي بيروسيكوينسينج متانة بيانات. بدلاً من ذلك، يمكن أن ريسيقوينسيد الأصلي Seq الميثيل المكتبات، وإضافة إلى ملفات القراءة لزيادة عمق القراءة. حيث يتم تحديد مستويات مثلايشن شبه كمي وأملت بعدد ما يلي: [(# of CpGs)/(# تبجس + المعبأة)]، زيادة عمق القراءة سوف يزيد البد المعطاة دقة قيمة النسبة المئوية مثلايشن. في هذه الدراسة، ونحن فقط نظرت المعبأة القيم مثلايشن التي حددت بعشرة على الأقل ما يلي: ويتحقق تغطية قراءة شاملة ل 19 x لكل البد.
منهاج Seq الميثيل الفئران لا يخلو من أوجه القصور. في حين أنها أكثر فعالية من حيث التكلفة من تسلسل الجينوم كل بيكبريتيت، أغلى بكثير من أساليب أخرى. ومع ذلك، كان معظم التكاليف شراء الممرات في التسلسل وليس لنظام التقاط. اعتماداً على عمق القراءة اللازمة، مع إجراء مقارنات عبر الأنسجة التي تتطلب أقل بسبب الاختلافات الكبيرة (25 – 70 في المائة)12 في مثلايشن الحمض النووي، يمكن تخفيض التكلفة الإرسال المتعدد أكثر العينات كل حارة واستخدام منصة أعلى قدرة. أيضا، يتم إعداد نموذج أكثر استهلاكاً للوقت من الأساليب الأخرى. بينما مماثلة إلى النهج المنسدلة الأخرى التي تتضمن تسلسل الجيل القادم، إضافة خطوات التحويل وتنقية بيكبريتيت المضافة لعبء العمل. إجمالاً، منصة Seq الميثيل بديلاً فعالاً من حيث التكلفة لتسلسل الجينوم الجامعة ويوفر القرار زوج قاعدي في المعبأة أكثر من 2.3 مليون، وأكثر بكثير من تلك التي جزيئي بالأنظمة الأساسية المستندة إلى ميكرواري. قد استخدمت حتى الآن، البشرية المتاحة تجارياً والماوس منصات الميثيل Seq لتوثيق التغيرات تعتمد على الكحول في25،الدماغ المكاك26، الجينات النمائية في الماوس الدماغ9، والدم والدماغ أهداف الكورتيزون10. علاوة على ذلك، يجعل من القدرة على استهداف مناطق معينة بغض النظر عن الاعتراف بتسلسل من إنزيمات التقييد منصة مثالية لإجراء مقارنات عبر الأنواع. لهذه الدراسة، قمنا بتصميم برنامج Seq الميثيل الفئران، التي يتم تنفيذ العديد من التجارب الدوائية والأيضية والسلوكية دون الاستفادة من أداة ميثيلوميك على نطاق الجينوم. وتظهر البيانات المتوفرة لدينا أنه يمكن استخدامها للكشف عن DMRs في نموذج الفئران من الإجهاد ويرتبط المعلمات الفسيولوجية الأخرى مثل مستويات البلازما عموما كورت.
منهاج Seq الميثيل مثالي لتجارب جينية في الحيوانات مع تسلسل الجينوم التي قد لا يكون لديك ما يكفي من الأدلة التجريبية التي توثق المناطق التنظيمية. عندما تتاح هذه المناطق، تكون مناطق إضافية خصيصا وتعلق على الإصدار الحالي. علاوة على ذلك، المنهاج مثالي لعلم الجينوم المقارن، نظراً لإثراء الهدف يعوقه عدم الاعتراف بإنزيم التقييد. على سبيل المثال، يمكن التقاط منطقة المروج للجينات أي اهتمام بغض النظر عن ما إذا كان أنها تؤوي موقع قيود محددة. وبالمثل، يمكن التقاط أي المناطق التنظيمية، مثل تلك المحددة في الماوس أو البشر، والتي يتم المحافظة عليها في جينوم الفائدة.
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة بالمعاهد الوطنية للصحة منحة MH101392 (RSL) والدعم من جوائز والأسس التالية: جائزة المحقق الشاب نارساد، مارغريت أن السعر المحقق، وجيمس واه مزاج اضطرابات الباحث صندوق عبر المؤسسة باور ت. تشارلز بيكر مؤسسة، ومؤسسة مطابقة المشروع (RSL).
Radioimmuno assay (RIA) | MP Biomedicals | 7120126 | Corticosterone, 125I labeled |
Master Pure DNA Purification Kit | Epicentre/Illumina | MC85200 | |
Thermal-LOK 2-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1102 | Used with 1.5 mL tubes |
Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | Vortex Mixer |
Ethyl alcohol, Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | 100% Ethanol, molecular grade |
Centrifuge 5424 R | Eppendorf | – | Must be capable of 20000 x g |
Qubit 2.0 | ThermoFisher Scientific | Q32866 | Fluorometer |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32850 | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | ThermoFisher Scientific | Q32851 | High sensitivity DNA detection reagents |
Qubit Assay Tubes | ThermoFisher Scientific | Q32856 | |
SureSelectXT Rat Methyl-Seq Reagent Kit | Agilent Technologies | G9651A | Reagents for preparing the Methyl-Seq library |
SureSelect Rat Methyl-Seq Capture Library | Agilent Technologies | 931143 | RNA baits for enrichment of rat targets |
IDTE, pH 8.0 | IDT DNA | 11-05-01-09 | 10 mM TE, 0.1 mM EDTA |
DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
Covaris E-series or S-series | Covaris | – | Isothermal sonicator |
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm (25) | Covaris | 520045 | |
Water, Ultra Pure (Molecular Biology Grade) | Quality Biological | 351-029-721 | |
Veriti 96 Well-Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4375786 | |
AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63880 | DNA-Binding magnetic beads |
96S Super Magnet | ALPAQUA | A001322 | Magnetic plate for purification steps |
2200 TapeStation | Agilent Technologies | G2965AA | Electrophresis-based bioanalyzer |
D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
D1000 ScreenTape High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 Reagents High Sensitivity | Agilent Technologies | 5067-5585 | |
DNA110 SpeedVac | ThermoFisher Scientific | – | Vacuum Concentrator |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 magnetic beads | Invitrogen | 65601 | Streptavidin magnetic beads |
Labquake Tube Rotator | ThermoFisher Scientific | 415110Q | Nutator Mixer is also acceptable |
EZ DNA Methylation-Gold Kit | Zymo Research | D5006 | Bisulfite conversion kit. Contains Binding, Wash, Desulphonation, and Elution buffers |
Illumina Hi-Seq 2500 | Illumina | – | Next-generation sequencing machine |
PCR and Pyrosequencing Primers | IDT DNA | Variable | |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England BioLabs | M0267L | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England BioLabs | N0446S | |
Pyromark MD96 | QIAGEN | – | Pyrosequencing machine |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | 70% Ethanol solution |
Sodium Hydroxide Pellets | Sigma-Aldrich | 221465 | 0.2 M NaOH denature buffer solution |
Tris (Base) from J.T. Baker | Fisher Scientific | 02-004-508 | 10 mM Tris Acetate Buffer wash buffer solution |
PyroMark Gold Q96 Reagents (50×96) | QIAGEN | 972807 | Reagents required for pyrosequencing |
PyroMark Annealing Buffer | QIAGEN | 979009 | |
PyroMark Binding Buffer (200 ml) | QIAGEN | 979006 | |
Streptavidin Sepharose High Performance Beads | GE Healthcare | 17-5113-01 | Streptavidin-coated sepharose beads |
PyroMark Q96 HS Plate | QIAGEN | 979101 | Pyrosequencing assay plate |
Eppendorf Thermomixer R | Fisher Scientific | 05-400-205 | Plate mixer. 96-well block sold separately (cat. No 05-400-207) |
SureDesign Website | Agilent Technologies | – | Target capture design software (https://earray.chem.agilent.com/suredesign/) |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | – | rat Nov 2004 rn4 assembly |
Agilent Methyl-Seq Protocol | Agilent Technologies | – | https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/G7530-90002.pdf |