測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

1. 楽器の準備 注: この実験私たちには、「膵島プレート」とタツノオトシゴ XF24 デバイスを使用していますいます。技術の操作は、測定室に物質を加える混合待機していると測定と同様、可能性の別のサイクルを使用します。 所望の温度に到達し、安定する十分な時間があるように、実験開始前によくマシンをオンにします。 ソフトウェアの設定 (管理モード)、カートリッジ校正の長さを選択 (ここでは、20 分が選ばれました)、所望の温度。注: ミトコンドリアや哺乳類の組織の測定は通常行ったうち 37 ° C,フライのヘッド周囲の温度は 25 ° C が 31 ° C での測定結果が公開されました。これは室温でデバイスの最低設定温度 31 ° C を使いました。25 の ° C の下の温度に達するに最近公開された2111 ° C、寒い部屋でマシンを配置すること。 ソフトウェアで、次のプロトコルを使用して、: 3 分-2 分待っている – 2 分測定を混合します。実験の設計によって選択した測定手順の後ポート A D から注入ステップを追加します。 品質チェック、および基底の OCR の定量は、ポート A経由で最初の薬物を注入する前に、少なくとも 3 つの計測サイクルを待つプロトコルの詳細なタイムラインを参照してください参照ベッカーら13. 2. カートリッジの準備 テスト前に、1 日 (または少なくとも 4 h) 中古カートリッジを調整します。各ウェルに Calibrant (pH 7.4) の 1.0 mL を追加し、CO2の一晩またはを 72 h 蒸発防止のため、パラフィルムでカートリッジの場合は 24 時間以上いる水和されている 37 ° C でプレートとストアの上にセンサー カートリッジを置きます。 実験薬、実験開始前によく溶解 (2.5% ブドウ糖 + 新鮮な媒体) の中でことを確認します。 測定し、薬剤注入時の pH の相違を避けるために所望の温度で車両の pH に薬液の pH を調整します。 その割り当てられたワイドボアインジェクターに薬液をピペットで移しなさい。たとえば、ポート A の 77 μ L を使用、1:10 を達成するために 770 μ L 溶液およびその後 85 μ L ポート B の希釈 マシンにカートリッジをロードし、校正を開始します。 3. プレート準備 注: 2 人が板を同時に準備することを強くお勧めします。2 人あたり 1 つのプレートの準備の期間があります 45 〜 60 分。 調整、作りたてメディア + 1 と目的の pH に 2.5% ブドウ糖は温度の変化 N 塩酸を確認 pH は影響は受けません。 アイス ボックスを準備し、氷の上に金属板を配置します。 アイレット プレート (24 ウェル プレート) パッケージを開くと、メディアでペトリ皿 (92 mm × 16 mm) でネットを浸します。 インサーター (井戸にネットをしっかりと配置する小さな楽器) の 1 つを集めるし、顕微鏡の横に立つインサーターがあります。インサーターに接続されているネット メディアの小滴を追加します。 (1 週間または 4 週間の古いカントンの男性はここで使用された) のハエをハエ冷たい金属プレート上に配置することによって麻酔します。 鉗子を使用すると、ハエの腹部をつかむし、顕微鏡下でペトリ皿でメディアに没頭します。 鉗子の 2 番目のペアを使用すると、ハエの頭を慎重に取り外します。インサーターに接続されているネットの真ん中に配置し、頭がメディアに没頭していることを確認します。 ネット上でそれらの 16 があるときは、頭を中心に。井戸でそれらを配置しながら頭の損失を防ぐためにヘッドを中心とする前に余分な液体を削除します。注: この番号メソッドの確立中にプレート準備の妥当な時間内で十分な安定したデータを与えた 16 飛ぶヘッドが使用されました。 インサーターを使用すると、よくネットを配置します。頭がネットの下で閉じ込められていることを確認します。ゆっくりと 700 μ メディア + 2.5% ブドウ糖 (図 1) を追加します。井戸のごとにプロセスを繰り返します。注: 20 井飛ぶヘッド サンプル、プレートごとのバック グラウンド補正の 4 空井戸が推奨されます。空井戸がバッファー + 2.5% ブドウ糖の 700 μ L とネットにはも含まれていることを確認します。 気泡、ネット経由で顕微鏡下の井戸を確認します。優しく上下に 1 mL ピペットを使用して任意の気泡を除去ピペットで移しなさい。信頼性の高い OCR 読み取り中心頭を維持します。 マシン プレートを追加し、測定を開始します。 4. OCR 測定結果の解析 プロトコルの最後に、カートリッジを取り外します。 品質チェックとしてポート詰め物で表示されている残り物を観察します。頭などによるタンパク質の抽出に使用をしない場合、カートリッジとプレート (オプション 1) を破棄 (オプション 2 を参照してください)。 スプレッドシート ファイルを抽出し、品質チェックそれぞれ酸素および pH のレベルのためによく。背景の井戸が OCR を示さない酸素レベルが安定していることを確認します。 データ分析、それぞれのソフトウェアで選択できるいくつかのアルゴリズムを使用します。酸素の範囲レベル (= サブ測定) 最初と最後の目盛の間、全体の測定の間に場合は OCR 値2用 AKOS アルゴリズムが 2 つの試料間で類似と最後のタイマー刻みの酸素レベルが 95 (より低いmmHg) (ヘッドの OCR は、著しく低いこの酸素レベル)、(図 2)。 いくつかの条件は急速な OCR を生成するサンプルになります、1stチック中に、最後のタイマー刻み (無酸素) (図 3 a)、低酸素レベルを表示ことがあります。このようなシナリオでは、固定のアルゴリズムなどの代替法を使用します。無酸素、OCR は、ソリューションにおける酸素の低レベルのため大幅に削減します。など、AKOS アルゴリズムは、誤った測定値を得られます。注: 新しいマシンは、固定アルゴリズムを欠いています。したがって、総酸素濃度を抽出し、最初の時間あたりの 3-5 タイマー刻み (図 3) をプロットすることが好ましい。 5. (オプション 2) 頭セグメントの生化学的解析 生化学測定する(代謝産物、プロテオーム等)頭セグメントのプロパティ; 要件に実行時間を調整します。ただし、いつでもプロトコルを中止し、プレートを除去することが可能です。 プレートを取り外したら、ネットに穴をあける、フロートに頭を解放削除非シャープ鉗子を使用します。 カットと 1 mL ピペットを使用してヒントし、頭をバイアルに転送します。 迅速にバッファーを破棄し、液体窒素で凍結するヘッド。将来の分析用-80 ° c ヘッドを格納します。