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Biochemistry

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58601
, , , , , ,
1Munich Center of Integrated Protein Science and Biomedical Center,Ludwig-Maximilians University of Munich, 2Laboratory for Metabolism and Epigenetics in Aging,Leibniz Institute for Farm Animal Biology (FBN), 3German Mouse Clinic, Helmholtz Zentrum Munich,German Research Center for Environment and Health (GmbH), 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5Chair of Experimental Genetics, School of Life Science Weihenstephan,Technische Universität München, 6Laboratory for Metabolism and Epigenetics in Brain Aging,Institute of Neuroregeneration & Neurorehabilitation of Qingdao University, 7Molecular Biology Division, Biomedical Center, Faculty of Medicine,Ludwig-Maximilians University of Munich

Summary

Messung der Veränderungen der Stoffwechselrate ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Progression von verschiedenen Krankheiten und Alterung. Hier präsentieren wir Ihnen eine neuartige Technik zur Messung der ganzen Kopf Sauerstoffverbrauch, die mehr ähnelt die physiologische Zustand und kann Hilfe bei der Aufdeckung von neuer Medikamenten, die mitochondriale Aktivität ändern.

Abstract

Geregelten metabolische Aktivität ist wichtig für das normale Funktionieren der lebenden Zellen. In der Tat ist veränderte Stoffwechselaktivität kausal verbunden mit das Fortschreiten von Krebs, Diabetes, Neurodegeneration und Altern um nur einige zu nennen. Zum Beispiel wurden Veränderungen der mitochondrialen Aktivität, metabolische Kraftwerk der Zelle, bei vielen solchen Krankheiten charakterisiert. In der Regel die Sauerstoff-Verbrauch der Mitochondrien galten eine zuverlässige Anzeige der mitochondrialen Aktivität und Messungen in einigen dieser Studien stützten sich auf isolierte Mitochondrien oder Zellen. Solche Bedingungen können jedoch nicht die Komplexität des gesamten Gewebes dar. Vor kurzem haben wir eine neue Methode entwickelt, die es die dynamische Messung von Sauerstoff Verbrauchsmengen aus ganz isoliert fliegen Köpfe ermöglicht. Durch die Verwendung dieser Methode, verzeichneten wir niedrigerere Sauerstoff-Verbrauchsmengen des Segments ganzen Kopf bei jungen im Vergleich zu im Alter von fliegen. Zweitens haben wir entdeckt, dass Lysin Deacetylase Inhibitoren den Sauerstoffverbrauch in den ganzen Kopf schnell ändern. Unsere neuartige Technik kann daher bei Aufdeckung neuer Eigenschaften von verschiedenen Drogen, helfen die Stoffwechselrate auswirken können. Darüber hinaus kann unsere Methode ermöglichen ein besseres Verständnis der metabolischen Verhalten in einer Versuchsanordnung, die physiologische Zuständen eher ähnelt.

Introduction

Geregelten Stoffwechselaktivität ist essentiell für das Überleben der Zellen und gesunde Funktion eines Gewebes. Deregulierten Stoffwechselaktivität nachweislich ausgiebig mit der Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten1verknüpft werden. Z. B. geringere Stoffwechselaktivität wurde zuvor beschrieben bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und altersassoziierter Speicher Beeinträchtigung2,3. Darüber hinaus ist mitochondriale Dysfunktion geglaubt, um der Alterung Prozess4,5ursächlich beteiligt sein. Auf der anderen Seite wurden höhere mitochondriale und metabolische Rate in Krebs Zellen6beschrieben wo der mitochondrialen Inhibitoren Tumorgenese7reduziert.

Ein Auslesen der Stoffwechselaktivität ist der Sauerstoff-Verbrauch (OCR) von Mitochondrien. Interessant ist, diese Art von Auslesen ergibt sich in erster Linie aus isolierten Mitochondrien oder Zellen, also die Mehrheit der was in der Literatur beschrieben basiert hauptsächlich auf einer Anzeige, die nicht den physiologischen Zustand ähneln. Es gibt jedoch einige Nachteile dieser Technik. Erstens kann das Protokoll der mitochondrialen Isolation möglicherweise seine Integrität8, beschädigen die relevanten Artefakt sein kann, beim Vergleich von Mitochondrien von jungen im Vergleich zu älteren Gewebe9isoliert. Darüber hinaus die Isolierung Prozess ist lang und Verlusten des entsprechenden Proteins posttranslationale Modifikationen die mitochondriale Funktion9,10,11Regeln führen kann. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass isolierte Mitochondrien nicht konsequent ganze Gewebe Stoffwechselraten12,13darstellen. Diese zellulären biologischen Komplexität als angesehen werden könnte, “das ganze ist mehr als die Summe seiner Teile”, z. B. Mitochondrien zeigt möglicherweise an verschiedenen Stoffwechselraten innerhalb einer komplexen Zelle gegenüber ihre metabolische Rate, wenn Sie isoliert.

Während Zellen eine bessere OCR auslesen als isolierte Mitochondrien anbieten können, kann Zelle zu Zelle Kommunikation im Kontext des gesamten Gewebes verloren gehen. Beispielsweise ist die Stoffwechselaktivität der Nervenzellen im Gehirn, stark abhängig von der Stoffwechselaktivität der benachbarten Gliazellen14. Als solche erweisen zur Gründung neuer Techniken, um OCR im gesamten Gewebe oder ganze Organismen untersuchen mehr aufschlussreich für die Entstehung und Progression von verschiedenen Erkrankungen.

Vor kurzem sind neue Techniken entstanden, um diese Probleme anzugehen und ermöglichen die Messung von OCR von ganzen Gewebe, Segment oder Lebewesen. Beispielsweise berichtet eine neuere Arbeiten die Sauerstoffmessung aus einen Käfer-Flug-Muskel durch einen permeabilized Faser Ansatz mit einem Respirometer15. Neue Maschinen für Mikro-Respirometrie ermöglichen die Messung von OCR von pankreatischen kleinen Inseln16,17. Infolgedessen wurde berichtet, dass diese Technologie die Messung von OCR von ganzen Würmer18 und Zebrafisch19 ermöglicht. Jedoch kann das Vorhandensein der Verdauungs-Schranke zum Testen von verschiedenen Drogen im Zusammenhang mit OCR Veränderungen eine Herausforderung. Interessanterweise haben die jüngsten Berichte von Neville und Kollegen eine neue Technik zur Messung der einzelnen Drosophila Larve Gehirn mit dem well-Platte20,21gezeigt.

In dieser Studie haben wir ein ähnliches Setup verwendet, ermöglichen die Messung der gesamten OCR von lebenden und nicht-mobilen Drosophila22. Diese Technik bietet auch einen sekundäre Vorteil bei der Messung der Auswirkungen von verschiedenen Drogen auf metabolische Aktivität in ein ganzes Segment, ohne durch das Verdauungssystem Barriere13,22übergeben. Beispielsweise war es zuvor demonstrierte, dass Lysin Deacetylase Inhibitor (KDACi), Direkteinspritzung ein Medikament geglaubt, epigenetischer Mechanismus im Gehirn, führte zu einer verbesserten Erinnerungen Bildung23ändern. Jedoch durch unsere neuartige Technik, entdeckten wir, dass KDAC Hemmung zu einem raschen Anstieg der OCR führte, die möglicherweise ein Faktor allein in der neuronalen Aktivität. Unser Protokoll bietet eine einfache und neuartige Methode zur Bewertung der Auswirkungen der verschiedenen Medikamente, genetische Manipulation oder physiologischen Zuständen (Krankheit, Altern) auf OCR im Zusammenhang mit einen ganzen Kopf.

Protocol

(1) Instrumenten-Aufbereitung Hinweis: Für dieses Experiment haben wir eine Seepferdchen XF24 Gerät mit”Inselchen” verwendet. Der Betrieb der Technik nutzt verschiedene Zyklen mischen, warten und Messungen sowie die Möglichkeit der Messung Fach Substanzen hinzu. Schalten Sie die Maschine rechtzeitig vor Beginn des Experiments, so dass es genügend Zeit, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und stabil bleiben. Wählen Sie in der Software-Setup (Admin-Modus), die Länge der Patrone Kalibrierung (hier 20 min gewählt wurde) und die gewünschte Temperatur.Hinweis: Während Mitochondrien oder Säugetier-Gewebe Messungen in der Regel durchgeführt werden, bei 37 ° C, fliegen Sie Kopf ambient Temperatur liegt bei 25 ° C, aber die Ergebnisse der Messungen bei 31 ° C veröffentlicht. Wir haben 31 ° C, da es sich bei dem Gerät bei Raumtemperatur die niedrigste Temperaturstufe. Um Temperaturen von 25 ° C oder darunter zu erreichen, stellen Sie die Maschine in einem kühleren Raum oder bei 11 ° C als kürzlich veröffentlichten21. In der Software verwenden das folgende Protokoll: 3 min. mischen – 2 min warten – 2 min messen. Abhängig von den experimentellen Design Injektion Schritte hinzufügen von Ports A-D nach einer gewählten Messschritt. Warten Sie für die Qualitätsprüfung und Bestimmung des basalen OCR mindestens drei Messzyklen vor der Injektion der ersten Medikament über Port A. Für eine detaillierte Chronik des Protokolls, siehe Referenz Becker Et al. 13 . 2. Patrone Vorbereitung Pre-kalibrieren Sie die Patrone einen Tag (oder mindestens 4 h) vor dem testen. 1,0 mL der Kalibrator (pH 7,4) in jede Vertiefung und der Sensorkassette oben auf der Platte und Speicher bei 37 ° C ohne CO2 für Übernachtung oder bis 72 h. vermeiden die Verdunstung der Patrone mit Parafilm wenn es länger als 24 h hydratisiert werden. Sicherstellen Sie, dass die experimentelle Medikamente gut vor Beginn des Experiments in das Medium (frisches Medium + 2,5 % Glukose) aufgelöst werden. Messen Sie und Regeln Sie den pH-Wert der Droge-Lösung für den pH-Wert des Fahrzeugs auf der gewünschten Temperatur keinen pH-Unterschied bei Injektion von Drogen zu vermeiden. Pipettieren der Wirkstofflösung an seinen zugewiesenen Injektion-Port. Z. B. 77 μL für Port A zu einem 01:10 Verdünnung in eine 770 μl Lösung und anschließend 85 μL für Port B. Laden Sie die Patrone in die Maschine und beginnen Sie Kalibrierung. 3. Platte Vorbereitung Hinweis: Es wird dringend empfohlen, dass zwei Personen gleichzeitig die Platte vorbereiten. Die Dauer der Vorbereitung einer Platte pro zwei Personen erfordern ~ 45-60 Minuten. Passen Sie die frisch zubereiteten Medien + 2,5 % Glukose zu den gewünschten pH-Wert mit 1 N HCl. Stellen Sie sicher, dass der pH-Wert nicht betroffen ist der Temperatur ändert. Bereiten Sie eine Eisbox und legen Sie eine Metallplatte auf dem Eis. Öffnen Sie das Inselchen Platte (24-Well-Platte) Paket und Tauchen Sie die Netze in einer Petrischale (92 x 16 mm) mit den Medien. Sammeln Sie ein Netz mit der Inserter (ein kleines Instrument, das im Netz fest in den Brunnen stellt) zu und haben Sie die Inserter stehen neben dem Mikroskop. Einen kleinen Tropfen der Medien an das Netz angeschlossen, der Inserter. Die fliegen (eine Woche oder 4 Wochen alten Kanton Männer wurden hier verwendet) zu betäuben, indem Sie die fliegen auf die eiskalte Metallplatte. Mit Pinzette, schnappen Sie sich den Bauch einer Fliege und Tauchen Sie ihn in den Medien in einer Petrischale unter die Lupe genommen. Mit einer zweiten Zange, entfernen Sie vorsichtig den Kopf der Fliege. Legen sie in der Mitte das Netz an der Inserter befestigt und stellen Sie sicher, dass der Kopf in den Medien eingetaucht ist. Zentrieren Sie die Köpfe, wenn es 16 davon im Netz gibt. Entfernen Sie überflüssige Flüssigkeit vor der Zentrierung der Köpfe, um Verlust der Köpfe zu verhindern, indem man sie in den Brunnen.Hinweis: 16 fliegen Köpfe wurden verwendet, da diese Zahl ausreichende und stabile Daten innerhalb einer angemessenen Frist der Platte Vorbereitung während der Methode Einrichtung gab. Mit der Inserter, legen Sie das Netz in den Brunnen. Stellen Sie sicher, dass die Köpfe unter dem Netz gefangen sind. Fügen Sie langsam 700 μl Medien + 2,5 % Glukose (Abbildung 1). Wiederholen Sie den Vorgang für jede der Vertiefungen.Hinweis: 20 Brunnen von fliegen Kopf Proben und 4 leere Brunnen für Hintergrund-Kalibrierung pro Platte wird empfohlen. Stellen Sie sicher, dass leere Brunnen auch ein Netz mit 700 μl Puffer + 2,5 % Glukose enthalten. Überprüfen Sie die Brunnen für die Luftblasen unter der Netze über das Mikroskop. Pipettieren sanft rauf und runter mit einer 1 mL pipettieren, um eventuell Luftblasen zu entfernen. Halten Sie die Köpfe für eine zuverlässige OCR lesen zentriert. Die Maschine der Platte hinzu und starten Sie die Messung. 4. Analyse der OCR-Messungen Am Ende des Protokolls entfernen Sie die Patrone. Als einen Qualitäts-Check beobachten Sie alle sichtbaren Reste in der Port-Füllungen. Die Patrone und Platte (Option 1) zu verwerfen, wenn die Köpfe nicht für Protein-Extraktion, z. B. verwendet werden (siehe Option 2). Extrahieren Sie die Kalkulationstabelle Dateien und Qualität kontrollieren jeden gut für Sauerstoff und pH Niveaus. Stellen Sie sicher, dass der Hintergrund Brunnen keine OCR zeigen und Sauerstoffgehalt stabil sind. Verwenden Sie einen Algorithmus für die Datenanalyse, von denen einige in der jeweiligen Software gewählt werden können. Verwendung der AKOS Algorithmus für OCR Werte2 wenn das Angebot an Sauerstoff während der gesamten Messung zwischen der ersten und letzten Tick Ebenen (= Sub-Messung) ähneln zwischen zwei biologischen Proben und der Sauerstoffgehalt der letzten Ticks sind nicht niedriger als 95) MmHg) (die Köpfe OCR ist deutlich niedriger bei diesem Sauerstoffgehalt), (Abbildung 2). Einige Bedingungen werden dazu führen, dass die Probe um eine schnelle OCR zu generieren und möglicherweise niedriger Sauerstoffgehalt angezeigt, während die 1St Zecke bzw. in den letzten Tick (Anoxie) (Abb. 3A). Verwenden Sie in einem solchen Szenario eine Alternative Messverfahren wie die festen Algorithmus. Die OCR ist Anoxie aufgrund des niedrigen Sauerstoff in die Lösung stark reduziert. AKOS-Algorithmus ergibt als solche irreführende Lesungen.Hinweis: Die neuere Maschine fehlt den feste Algorithmus. Daher ist es bevorzugt, den gesamten Sauerstoff-Niveaus zu extrahieren und Plotten der Rate pro Zeit für die ersten 3-5 Zecken (Abbildung 3). 5. (Option 2) biochemische Analyse des Segments Kopf Die biochemische messen (Metaboliten, Proteom, etc.) Eigenschaften eines Kopfes Segments passen Sie die Laufzeit der Anforderung; jedoch ist es möglich, das Protokoll jederzeit abbrechen und entfernen die Platte. Sobald die Platte entfernt wird, verwenden Sie nicht geschärft Zange macht ein Loch in das Netz und entfernen es dadurch lösen die Köpfe zu schweben. Mit Hilfe einer 1 mL Pipettieren mit einem Schnitt Tipp und die Köpfe zu einem Fläschchen zu übertragen. Schnell verwerfen Sie den Puffer zu und Snap-Freeze die Köpfe in flüssigem Stickstoff. Speichern Sie die Köpfe bei-80 ° C zur späteren Analyse.

Representative Results

Die Möglichkeit, qualitativ hochwertige OCR Messung aufzunehmen stützt sich auf die Zentrierung der Kopf in der Mitte des Netzes (Abbildung 1). Dies ist wichtig für die XF24-Maschine, die hat einen eher kleine Sauerstoff-Sensor vor Ort im Vergleich zu den neueren XFe24-Maschine, in der der Sensor größer ist. Wie bereits gezeigt, Zentrierung die Köpfe einer stetigen OCR für mindestens 20 aufeinander folgenden Messungen in jungen fliegen13angezeigt. Ein kritischer Aspekt bei der Verwendung der Maschinen ist die korrekte Analyse anwenden. Es wird empfohlen, die Sauerstoff-Niveaus während der Experimente zu überprüfen. Jede 2 min Messung gliedert sich in 10 Sub-Messungen (Zecken). Ein Brunnen mit 16 gesunde Köpfe zeigt in der Regel ein Sauerstoffpartialdruck (pO-2) von 140-170 (MmHg) für die erste Zecke. Im ersten Beispiel verglichen wir junge vs. midlife fliegen Köpfe (Abb. 2A und 2 b). Während der Sauerstoff in den mittleren Alters Köpfen schneller sinkt, der beobachtete Unterschied ist gering (Abbildung 2A). Darüber hinaus gleicht sich das Leistungsspektrum der Sauerstoffgehalt zwischen den Bedingungen, mit 165 während der ersten Tick auf 120 während der letzte Tick. In einem solchen Fall ist es vorzuziehen, AKOS Algorithmus zu verwenden, zum automatischen Generieren von OCR (Pmol/min)2, die zuverlässig den Sauerstoff Ebene Tropfen zwischen jungen versus midlife Köpfe (Abbildung 2 b) widerspiegelt. Der Hinweis wählt das Analyseprogramm von der Maschine automatisch den AKOS-Algorithmus. Aber aufgrund unserer Beobachtungen, automatisch mit dem AKOS Algorithmus irreführend geben kann, wenn nicht Gegenteil ergibt sich für die richtige OCR. Diese Artefakte können unter den Bedingungen einer höchst raubend Probe die Anoxie13,22erreicht generiert werden. Beispielsweise ändert der Zusatz von Natrium Butyrate (SB), ein KDAC-Hemmer, vorübergehend die Dynamik des Sauerstoff-Niveaus (Abbildung 3A). Während der Fahrzeug-Kontrollen stetige Konzentrationen von Sauerstoff während der ersten und letzten Zecken anzuzeigen, verursacht SB Zusatz einen erheblichen und Transienten Tropfen der Sauerstoffgehalt in diese Zecken (Abbildung 3A). SB alleine ändert nichts an der Sauerstoffgehalt in den Hintergrund-Brunnen, wo keine Köpfe (Daten nicht gezeigt) hinzugefügt werden. Die Daten unterstützen die Vorstellung, dass SB Sauerstoffverbrauch steigt. Wie die Sammlung der ersten Tick (12 Sekunden verzögert wird, bis die erste Zecke in der Messphase aufgezeichnet wird) ist der erste Datenpunkt in der SB behandelt Wells bereits niedriger. Daher ist es schwierig, die frühen Veränderungen im Sauerstoff-Verbrauch nach dem Hinzufügen dieser HDAC-Inhibitor zu erfassen. Darüber hinaus werden der Sauerstoffgehalt in den SB behandelt Proben bereits niedrigen Niveau (Anoxie) reduziert, wie durch die Sammlung der letzten Ticks. Bei Sauerstoffmangel verlangsamen die Köpfe ihrer Sauerstoff-Verbrauch in den letzten Zecken (Abb. 3A). Da die AKOS-Berechnung alle Zecken berücksichtigt und einen anoxischen Zustand ignoriert, generiert es eine irreführende OCR. In der Tat basiert nicht normalisierte AKOS OCR Ebenen zeigen wenig Veränderung auf die Injektion (gestrichelte Linie) von Port ein (Veh/SB) (Abb. 3 b). Normalisierung der OCR-Ebenen auf die Voreinspritzung Messung anhand der AKOS zeigt sehr ähnliche Niveaus der OCR vor und nach der Injektion von Port A, die die Sauerstoff Pegeländerungen (Abbildung 3A) nicht unterstützt. Unter diesen Umständen empfiehlt der feste Algorithmus, der eher Modelle/OCR und Sauerstoff Pegeländerungen ähnelt (Abbildung 3). Infolgedessen normalisiert die feste Algorithmus basiert Messung zeigt eine erhöhte OCR auf SB Behandlung (Abbildung 3). Ein Nachteil mit der neuen Maschine ist das Fehlen des festen Algorithmus. Daher, in Experimenten wo sehr aufwendig Probenbehandlung/verwendet wird, es wird empfohlen, die OCR-Messungen manuell berechnen, und berechnen die Abnahme der Sauerstoff pro Zeit für das erste level 3-5 Zecken bei jeder Messung. Abbildung 1 . Ein Beispiel eines Brunnens mit 16 ein – Wochen alten Köpfe der männlichen fliegen. Die Köpfe sind zentriert unter einem Netz und schwebend in den Medien. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 2 . Ein repräsentatives Beispiel für OCR Messung Vergleich zwischen 1 – Wochen alten fliegen Köpfe (jung) und vier – Wochen alten fliegen Köpfe (mittleren Alters). (A) die Sauerstoffwerte sind für drei getrennte Messungen gezeigt; jede 2 min Messung gliedert sich in zehn Sub-Messungen (Zecken). (B) eine Quantifizierung von (A). Das Niveau der ersten und letzten Ticks sind ähnlich, obwohl die Ebenen der mittleren Alters Probe etwas niedriger sind. Eine Quantifizierung der Neigung der die Abnahme des Sauerstoffgehalts wird verwendet, um die OCR-Ebenen zu erzeugen. Wie zuvor beschrieben22ist die OCR der mittleren gealterten fliegen 10-15 % höher als junge fliegen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur. Abbildung 3 . Ein Beispiel für die Veränderung von OCR von Natrium Butyrat (SB) in jungen Köpfen fliegen. (A) Sauerstoff-Niveaus von sieben Messungen nach Zugabe von 15 mM SB aufgenommen. Die gestrichelte Linie markiert die Injektion des Medikaments (oder Fahrzeug) von Port A. Der Hinweis, während die Sauerstoffwerte von Zecken 1 und 10 in der Kontrollgruppe (blau), stabil bleiben die Konzentrationen von Sauerstoff während diese Zecken sind vorübergehend (sechs Messungen nach der Injektion) reduziert in den SB behandelt Proben (Orange). Darüber hinaus ist die Abnahme der Sauerstoff-Niveaus während der letzten Zecken SB behandelt Proben stark reduziert. N = 3 pro Gruppe (B) [Links] nicht normalisiert OCR Ebenen aus der AKOS-Algorithmus berechnet. Die Berechnung zeigt fälschlicherweise vergleichbarem OCR, vor und nach der Injektion von SB von Port A. [rechts] Normalisierung der OCR zur Messung vor der Injektion von Port A. (C) [Links] ‘Fixed’ Algorithmus Berechnung von (A) zeigt die nicht normalisierte OCR . Hier stellt die OCR eng die vorübergehenden Anstieg der Sauerstoffverbrauch der Köpfe auf SB Behandlung; [Rechts] Normalisierung der OCR zur Messung vor der Injektion des Hafens, die A. Fehler Balken zeigen die S.E.M in den Diagrammen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Discussion

Unsere neue Technik bietet einen neuartigen Ansatz um Stoffwechselveränderungen im Altern und Krankheit im Zusammenhang mit der gesamten fliegen Kopf Segmente22zu studieren. Die Methode kann auch angepasst werden, um die Auswirkungen von KDAC Natrium Butyrate auf Sauerstoffverbrauch zu untersuchen. Wie wir gezeigt haben, führen Lysin-Deacetlyase-Hemmer (HDACs/KDACs) OCR Veränderungen. Im Wesentlichen die Ziele solcher Inhibitoren normalerweise nicht in den Mitochondrien lokalisiert sind (diese Inhibitoren haben keine Auswirkungen auf die Klasse III Deacetylases, die Sirtuine)24, solche Medikamente konnten nur getestet auf eine mindestens Gewebe Ebene. In der Tat sind verschiedene Medikamente direkt an das Gehirn, also unter Umgehung möglich Bearbeitung/Änderung/Inaktivierung durch das Verdauungssystem injiziert. So steht Ihnen unsere Technik Roman Einblick, wie solche direkt Auswirkungen Medikamente Segment Kopf.

Es gibt mehrere wichtige Schritte. Zuerst, wie im Protokoll erwähnt, wir empfehlen Vorbereitung einer Platte unter einer Stunde mit zwei paar Hände, die Vorbereitung der Plattenrandes. Aus unserer Erfahrung sind die Qualität und Stabilität der OCR Messungen besser, wenn Sie in einer fristgerechten Weise vorbereitet. Wenn zu lange dauert, ist das Auftreten von niedrigen OCR raubend Brunnen sowie kürzere Dauer der stabilen OCR erhöht. Zweitens ist es wichtig, einen Qualitäts-Check durchzuführen und sicherzustellen, dass die experimentellen Bedingungen zwischen verschiedenen Proben sind ähnlich (pH-Wert, Sauerstoffgehalt). Schließlich ist ein entscheidender Schritt den korrekten Algorithmus zur Analyse der Proben auswählen. Wie wir gezeigt haben, ergab der Standardalgorithmus AKOS eine irreführende und manchmal gegensätzliche Berechnung in Proben, die bei hohen13Sauerstoff verbraucht. Deshalb betonen wir die Bedeutung der Überprüfung der unformatierten Daten für Sauerstoffgehalt und vergleicht die daraus resultierende OCR.

Derzeit gibt es mehrere Einschränkungen mit dieser Technik. Bei Raumtemperatur, die Maschine heizt bis zu 31 ° C (Dies ist die minimale Messtemperatur, während die Maschine bei Raumtemperatur), die ein Spannungszustand für die fliegen Köpfe25darstellen kann. Dies kann jedoch überwunden werden, indem die Maschine in einem kalten Raum, die Messungen bei 25 ° C ermöglichen und damit ohne eine mögliche Hitzestress zu fliegen Köpfe. Den letzten Bericht hat gezeigt, platzieren die Maschine bei 11 ° C, wodurch es OCR-Aufnahme von fliegen bei 25 ° C21. Dennoch sollte die Fliege Kopf Trennung bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Darüber hinaus Temperaturschwankungen machen es schwierig, Steuerungsänderungen pH-Wert und daher ist es dringend empfohlen, die Auswirkungen der physiologischen Bedingungen/Drogen auf OCR mit ähnlichen Versuchsaufbauten testen. Darüber hinaus wurde der Beitrag der Sauerstoffverbrauch durch mitochondriale-unselbständige Mechanismen etablierte26noch nicht. Durch die Verwendung verschiedener Atemwegserkrankungen Inhibitoren, die effizient in fliegen Köpfe, wäre es möglich, solche nicht mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu etablieren.

Es ist bemerkenswert, dass verschiedenen Säugetiere Krankheiten durch Veränderungen im Energiestoffwechsel gekennzeichnet sind. Darunter sind Krankheiten, die durch entweder metabolische Reduktion wie Alzheimer oder metabolischen auszeichnen wie Krebs Neuverkabelung. Interessanterweise sind KDAC-Hemmer für die Behandlung von Alzheimer und Krebs27verwendet. Während die genauen Mechanismen, durch welche, die KDAC Inhibitoren den therapeutische Aspekt erreichen, unklar bleiben, unterstützt die Daten aus unserer Technik der neuartige Vorstellung, dass solche Inhibitoren Stoffwechsel modulieren können.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist diese Methode wertvolle Messung insgesamt Sauerstoffverbrauch in Vivo Preise und mehr zeigt genau Drogenwirkungen auf allgemeinen Stoffwechsel, die in isolierten Mitochondrien Protokolle12übersehen werden kann. Zum Beispiel haben Ergebnisse, die von dieser Methode, sondern als bisherige Techniken, neue Einblicke für Alters-assoziierten metabolischen Inflexibilität bei KDAC Behandlung verwickelt. Zusätzliche Arbeit ist notwendig, optimieren die experimentellen Bedingungen für fliegen Köpfe, die Kombination von Technik und geeignete Analyse kann zur weiteren Aufklärung der mitochondrialen Aktivität im Rahmen des lebenden Gewebes führen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Andreas Ladurner, Carla Margulis und ihre Teams für umfangreiche experimentelle Unterstützung. Wir danken für ihre Kommentare in das Manuskript Caitlin Ondracek. Wir möchten danken, dass Sofia Vikstrom half uns bei der Festlegung der frühen Phasen dieser Technik. Wir danken auch können Sanderhoff für ihre technische Hilfe. LB wird vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (Infrafrontier Grant 01KX1012) finanziert. SP wurde durch ein AXA Research Fund postdoctoral Fellowship und der NSFC (Grant-Nummer 81870900) finanziert. AVV wird durch die QBM finanziert.

Materials

Glucose Sigma-Aldrich G8644 D-(+)-Glucose solution 100 g/L in H2O, sterile-filtered
XF assay Medium Agilent 103575-100 Seahorse XF DMEM Medium, pH 7.4
Sodium butyrate Merck 817500 Dissolved in XF assay buffer
Seahorse XF24/e24 analyzer Agilent
XF24/e24 Extracellular Assay Kit Agilent 100850-001 Cartridge
XF24/e24 Islet Capture Microplates Agilent 101122-100 Plate
Seahorse Capture Screen Insert Tool Agilent 101135-10 Insertor
Petri dish Sarstedt 821,472 Petri dish 92 x 16 mm
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References

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Dietz, L. J., Venkatasubramani, A. V., Müller-Eigner, A., Hrabe de Angelis, M., Imhof, A., Becker, L., Peleg, S. Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments. J. Vis. Exp. (143), e58601, doi:10.3791/58601 (2019).
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