Prueba de enfoque in-pen no invasiva para cerdos alojados en laboratorio

Las lesiones leves en el cerebro que no resultan en cambios anatómicos y estructurales y ondificantes detectables con imágenes de última generación pueden ser difíciles de identificar y tratar^28. Sin embargo, los pacientes con mTBI son especialmente vulnerables a insultos adicionales que pueden causar daños significativos en el cerebro, y por lo tanto, es importante que esta población sea identificada. Las pruebas conductuales desarrolladas en un modelo de mini-cerdo de mTBI son especialmente relevantes para los pacientes humanos mTBI porque los cerdos tienen una fisiología similar a los humanos y expresan estados afectivos similares, como la anhedonia^{8,9,10 ,20}. Aquí, hemos desarrollado una prueba conductual no invasiva, en la pluma (el HAT), y hemos demostrado que es lo suficientemente sensible como para distinguir los cerdos mTBI de los cerdos falsos. Además, se desarrolló un índice ponderado (la IA) para comportamientos observados durante el HAT que son omnipresentes entre los tipos de vivienda y cerdo.

Modificaciones y solución de problemas:

Las metodologías para el HAT se establecieron sobre la base de las directrices de etología²⁵ yvarias estrategias de ensayo y error para mejorar la fiabilidad, repetibilidad y validez de la prueba 6. Las medidas de fiabilidad ayudaron a identificar las fortalezas y limitaciones de la prueba. La fiabilidad define hasta qué punto la medición es repetible y consistente y libre de errores aleatorios^28,29. Hemos informado previamente sobre la fiabilidad intra e interobservador del HAT, y con los etogramas estructurales adicionales, las relihabilidades son igualmente altas (R² > 0,90) de Pearson para la duración⁶. Las medidas de frecuencia y latencia requieren observadores capacitados, mientras que las medidas de duración son menos dependientes de los observadores y, por lo tanto, más fiables en todos los laboratorios³⁰.

La fiabilidad dentro de un laboratorio y la repetibilidad en todos los laboratorios dependen de los métodos. En nuestro laboratorio, el sistema de vídeo grabado continuamente, los archivos se almacenaron inicialmente como archivos de 5 minutos, y algunas sesiones HAT se produjeron a través de dos archivos. Se cometieron menos errores cuando se utilizó la hora exacta de la hoja de datos para recortar y combinar los videos. Antes de desarrollar el etograma, se permitió a los observadores pausar, detener y rebobinar el material de archivo de vídeo para marcar la hora de todos los comportamientos en todo el etograma. Este método no sólo causó variación en la marca de tiempo de cada muestra, que oscilaentre entre 3 min y 20 min, sino que la confiabilidad entre y dentro del observador también era pobre para la mayoría de los comportamientos. Por lo tanto, establecemos la velocidad de reproducción y tuvimos observadores marca de tiempo cada categoría a la vez. Por lo tanto, cuando la fiabilidad era baja en una sola categoría, los observadores retimestamparon independientemente solo la categoría en lugar de todo el ethogram, después de consultar las definiciones y el material de archivo juntos. Los métodos set playback y category permitieron una predicción coherente de cuánto tiempo se necesitaba para hacer una hora de tiempo en cada muestra. Para los proyectos que abarcan más de un mes, es importante medir la revisión rutinaria de los vídeos codificados y la fiabilidad dentro del observador.

Otro factor que reduce la fiabilidad y la repetibilidad es la configuración de vídeo. Inicialmente, se utilizaron una cámara de mano y un trípode, que se movieron de la pluma a la pluma. Cuando se utilizó este método, los cerdos necesitaban ser introducidos en el trípode y la cámara antes del HAT; de lo contrario, los cerdos parecían reaccionar al trípode y el movimiento más que al humano de prueba. Además, los ángulos de cámara no sobrecargados limitaron la vista del observador durante la marca de tiempo y la percepción de profundidad del espacio aumentó la variación dentro y entre observadores en las medidas de comportamiento espacial; por lo tanto, desarrollamos el protocolo con cámaras fijas. Cuando se utiliza este método, se necesita un cuidado adicional para asegurarse de que la cámara se coloca correctamente antes de cada prueba, y se necesita más tiempo para la configuración entre la sesión de cada cerdo. Sin embargo, nos enteramos de que el sistema de sobrecarga de vídeo continuo necesitaba iniciar su grabación inicial a medianoche al menos 24 horas antes del primer HAT. La visualización de la marca de tiempo para muchos sistemas de vídeo no es precisa y está sincronizada con el fotograma; por lo tanto, ya no dependemos de los tiempos de visualización. Los inicios de medianoche permiten la captura exacta de fotogramas y la edición de vídeo, y no se utilizó la visualización de la marca de tiempo.

Además, la aclimatación de los cerdos y la configuración de una rutina era importante a la hora de solucionar este problema de esta prueba. En imágenes de cerdos que no estaban bien aclimatados a sus ambientes, se observó ritmo durante el HAT. Este es un indicador de que el cerdo puede estar en un estado agitado³¹ en lugar de en un estado exploratorio³². Los períodos de aclimatación de tres o más semanas pueden reducir el número de cerdos que aceleran en un experimento. Sin embargo, si el ritmo persiste a lo largo de todos los períodos de muestreo, este etograma puede necesitar ser ajustado para incluir paseos y permanecer quieto.

La validez es la medida en que una medida representa el alcance previsto de la pregunta que se formula²⁵. Al desarrollar por primera vez el HAT, usamos sólo un etograma espacial. Las definiciones de comportamiento etograma espacial describen con precisión y específicamente la proximidad a los sujetos humanos y le dicen al observador directamente cuánto espacio deja el cerdo entre sí y un humano. Sin embargo, una vez que estos métodos son necesarios para ser aplicados a una nueva configuración de laboratorio, reconocimos que los etogramas espaciales son específicos del laboratorio. Las dimensiones de la pluma y la colocación de otros objetos influyen en el resultado del etograma espacial; por lo tanto, será necesario publicar un diagrama con medidas y detalles de la pluma si la configuración de la pluma no se ha notificado previamente. Además de informar sobre el entorno de la pluma, los comportamientos estructurales se agregaron al etograma. A diferencia de los comportamientos espaciales, los comportamientos estructurales se pueden evaluar más fácilmente en todos los laboratorios; estos comportamientos tienen validez porque describen específicamente el nivel de estado activo del cerdo. Cuando un cerdo está descansando, es probable que no esté motivado para acercarse y es incapaz de cambiar de posición para acercarse tan rápido como un cerdo de pie. Del mismo modo, un cerdo que muestra NNOB está en un estado exploratorio, pero un cerdo con la cabeza quieta mientras está de pie es más probable en un estado catatónico. La orientación de la nariz ayuda con la validez porque la nariz, las orejas y luego los ojos son lo que el cerdo utiliza para recopilar información sobre el ser humano.

Limitaciones de la Técnica:

Una preocupación potencial con esta técnica es la variabilidad en las respuestas de los cerdos al test-humano. Además, los cerdos mirarán las manos del humano de prueba, lo que puede causar indicaciones involuntarias por parte de esa persona. Por lo tanto, estas limitaciones se expresaron mediante la prueba experimental de 1) las respuestas de los cerdos a un ser humano familiar y desconocido, y 2) estandarizando que, después de que el pellet se deja caer, los puestos humanos de prueba se detienen y colocan sus manos fuera de la la vista del cerdo. Los datos mostraron que no hubo tratamiento o tratamiento x diferencias de tiempo durante el HAT (Tabla 2), lo que sugiere que el HAT podría ser administrado por seres humanos familiares o desconocidos. Otros investigadores sugieren que los cerdos tienden a generalizar sobre los seres humanos sobre la base de interacciones anteriores^11,12,13; por lo tanto, las experiencias previas de un cerdo con los seres humanos deben ser positivas. Este desafío también se puede remediar con un diseño experimental vigilante; para cada bloque, se necesita un número suficiente de unidades experimentales representadas para cada tratamiento de interés.

En este estudio, aunque sólo había dos observadores experimentados marcando la marca de todos los videos para los tres tipos de alojamiento, hubo diferencias entre los tipos de alojamiento para resultados de comportamiento específicos (Tabla1). Por ejemplo, los cerdos de la vivienda tipo B entraron en la zona más cercana con más frecuencia que los de las clases de alojamiento A y C. Esto es probablemente debido a una diferencia en el material de la pluma; en la carcasa tipo B, la parte delantera de la pluma era una puerta ligada a una cadena con barras horizontales que permitían al cerdo subir la puerta durante el HAT. Los tipos de carcasa A y C, por otro lado, tenían barras verticales y menos superficies horizontales para que los cerdos se subieran. Esta variabilidad se puede remediar añadiendo el gasto de duración en las áreas cercanas y más cercanas antes de compararlas entre los tipos de vivienda (Tabla 1; P > 0,10). Sin embargo, los cerdos de la vivienda tipo C pasaronmás tiempo en la zona más alejada que los de los tipos de alojamiento A y B (Tabla 1; P < 0.05), que probablemente se debió a la colocación de riegoes en la parte posterior de la pluma en lugar de en la parte delantera de la pluma. Esta es una limitación que se puede remediar si los laboratorios deciden estandarizar la colocación de regaderos, cuencos y juguetes y asegurarse de que estén fijos para que el cerdo no mueva el objeto a otra área.

Esta prueba tiene una gran accesibilidad para laboratorios de todo tipo, pero, como se mencionó anteriormente, el etograma espacial estampado manualmente y las mediciones variarán más entre los laboratorios. Sin embargo, los etogramas estructurales del cuerpo y la cabeza son omnipresentes. Los laboratorios que tienen acceso a un seguimiento automatizado y validado para cerdos pueden beneficiarse al tener el ethogramespacial rastreado automáticamente en lugar de manualmente porque la distancia movida y la tasa de movimiento pueden ser resultados adicionales de las medidas de comportamiento de el HAT. Las limitaciones de la configuración en la pluma y las tecnologías tradicionales en lugar de las áreas de prueba y las tecnologías de seguimiento automático pueden solucionarse mediante la adaptación de la fórmula de IA. La IA proporciona mediciones estandarizadas y terminología de cómo los cerdos individuales utilizan su espacio de pluma y expresan interés en un ser humano. Este cálculo, derivado de medidas de comportamiento comunes, es sensible a los modelos porcinos de mTBI subconcusivo y, posiblemente, otros estados de lesión subclínica o enfermedad. Además, la IA reduce las variaciones aleatorias durante la experimentación y puede compararse más fácilmente entre experimentos y laboratorios que los métodos que se basan en mediciones más específicas del experimento. Los comportamientos estructurales proporcionaron la base para esta fórmula, porque estos comportamientos son mediciones estándar en todos los tratamientos, mientras que los comportamientos espaciales dependen de la configuración de la pluma, el número de cerdos en un lápiz y el sistema de seguimiento. Por ejemplo, observamos que cuando dos cerdos sanos son probados en un bolígrafo, realizarán comportamientos espaciales similares acercándose juntos, pero el cerdo que sigue al primero puede orientar su nariz más hacia su pequera que hacia el humano y expresar más NNOB , porque el cerdo que lleva sirve como centinela. Sin embargo, la IA ayuda a reducir esta variación incluso de comportamientos emparejados.

Aunque la IA es un excelente conjunto de herramientas para estandarizar la prueba en todos los laboratorios, los investigadores todavía pueden querer examinar los resultados de comportamiento específicos de la prueba dentro de un laboratorio o experimento, especialmente si tienen suficiente potencia (es decir, unidades experimentales y pruebas repetidas) en un solo experimento. Por lo tanto, la Tabla 1, que contiene todos los resultados del comportamiento, la varianza, la distribución y una prueba calculada para el número de animales para cada comportamiento específico, se incluyó aquí. Por ejemplo, si los investigadores tienen entornos de pluma que permiten a los cerdos subir constantemente durante el HAT y saben que su tratamiento causa más de una diferencia del 75% en los comportamientos de escalada, entonces pueden justificar el número de animales en función de la varianza medida. Si se añaden nuevos comportamientos al etograma, los científicos tendrán que justificar qué comportamientos son indicativos de enfoque o retirada antes de incorporarlos al índice. Por ejemplo, si la mayoría de los animales dentro de un ritmo de experimento a lo largo de las paredes de la pluma (es decir, thigmotaxis)³², la duración de este comportamiento podría incorporarse a la categoría de etograma estructural del cuerpo. El comportamiento podría representarse en el gráfico de barras apiladas detallado (es decir, la figura5) o en la forma tabular y, a continuación, se puede resumir con stand-still antes de aplicar el cálculo del índice. La IA, por lo tanto, puede representar comportamientos que son omnipresentes entre los laboratorios, pero los comportamientos únicos adicionales todavía se pueden representar por separado.

Importancia con respecto a los métodos existentes:

Se establecieron los métodos existentes para la HAT para que los cerdos de las granjas comerciales evaluaran el bienestar animal. Aquí, se ha establecido un protocolo para cerdos de laboratorio, que puede ayudar a los investigadores a evaluar el bienestar animal y distinguir los cerdos mTBI de los cerdos tratados con farsa. Una prueba tradicional alternativa podría ser utilizar una prueba de campo abierto. Esta prueba se utilizó anteriormente para evaluar la emocionalidad y el bienestar del cerdo^33. Las pruebas de campo abierto fueron diseñadas originalmente para probar los estados afectivos de los roedores midiendo su aversión natural al espacio abierto y la luz. Por el contrario, los cerdos sanos pueden ver los mismos estímulos que los¹⁰appetitivos, y después de una enfermedad, lesión o tratamiento de estrés, es probable que expresen miedo. Esta prueba requiere más espacio de laboratorio y requerirá que los cerdos se aclimaten a ser manipulados y colocados en un campo abierto. Si los laboratorios tienen espacio y existen protocolos para el manejo de los cerdos, las sesiones repetidas de HAT, además de una prueba de campo abierto, pueden ayudar a distinguir aún más a los animales tratados de los animales tratados con esham.

Pasos críticos dentro del protocolo:

Los tres primeros pasos del protocolo son los más críticos para las medidas HAT exitosas. Las sesiones por cerdo solo tardan 3 minutos; sin embargo, una preparación adecuada ayudará a que esta prueba sea confiable. Como se indicó anteriormente, la ubicación de la cámara y la configuración de grabación es crucial para la claridad y la replicación. Los ángulos de cámara incorrectos pueden limitar la visión del observador, lo que añadirá errores a las mediciones. Otro paso a menudo pasado por alto es la fijación de los objetos en la pluma. El cerdo moverá objetos no fijos, y esto puede afectar su motivación para acercarse al ser humano. El sistema de configuración y gestión es importante porque los cerdos deben aclimatarse a sus entornos antes de poder realizar la prueba de forma coherente. Los cerdos que no están bien aclimatados a sus bolígrafos caseros o rutina o que están experimentando estrés defecarán en otras áreas en lugar de en la parte posterior de la pluma^34. El área de defecación puede afectar su motivación para acercarse. Desde la vista de la cámara, el observador debe ser capaz de identificar cerdos individuales; sin embargo, es importante que el esquema de marcado no proporcione información sobre el tratamiento del animal, ya que esto sesgará al observador²⁵.

Identificar cerdos es muy importante para obtener los datos de comportamiento correctos para el cerdo adecuado, incluso cuando son de una sola casa. Los cerdos a menudo son movidos para sus tratamientos, y una marca reasegura al observador que están observando el mismo cerdo después de que ha sido removido y colocado de nuevo en su pluma. Los cerdos pueden ser alojados en parejas, como en la vivienda tipo C, y por lo tanto, se vuelve muy importante identificar a los cerdos. Las pinturas y marcadores de marcado de ganado requieren aplicación diaria; por lo tanto, este protocolo requiere el uso de una cinta de grado médico y un frotis de cemento de etiqueta. La cinta se pega mejor a los cerdos con el pelo más largo. Los cerdos con el pelo corto y la piel seca se desprenden de la cinta con más frecuencia que los cerdos con el pelo más largo.

Aplicaciones futuras:

En resumen, la prueba DE HAT en la pluma no invasiva que se describe aquí es lo suficientemente sensible como para detectar cambios dependientes leves y temporales en cerdos después de mTBI. Además, hemos desarrollado un índice ponderado llamado IA para evaluar los cambios en los cerdos alojados en diferentes tipos de plumas, así como en diferentes tipos de cerdos. Aunque el HAT se ha utilizado para detectar cambios en los cerdos expuestos a mTBI, esta prueba de comportamiento puede ser útil para detectar cambios de comportamiento medibles en animales que experimentan estrés o condiciones prepatológicas.