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Behavior

实验室安置猪的非侵入性、笔内方法测试

Published: June 05, 2019
doi:
10.3791/58597
, , , , , , , , , ,
1Animal Sciences and Industry,Kansas State University, 2DynaSim Technical Services, INC, 3Center for Injury Biomechanics,Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Applied Research Associates, Inc., 5Lucent Research, LLC, 6Department of Neurological Surgery,University of Washington

Summary

该协议描述了一种新的行为测试——猪家笔中的人类方法测试——用于检测亚脑震荡创伤性脑损伤后实验室猪的功能缺陷。

Abstract

创伤性脑损伤(TBI)在平民和军人中都有所增加,许多研究人员正在采用一种猪模型来治疗TBI。与TBI的啮齿动物模型不同,很少有行为测试被标准化。比啮齿动物在试验区里,较大的动物需要更多的侵入性处理,这可能会给动物的反应增加压力和变化。在这里,描述了人类方法测试(HAT),这是开发在实验室猪的家笔前进行的。它是非侵入性的,但足够灵活,它允许在住房设置的差异。

在HAT期间,开发了三个行为内周图,然后应用了一个公式来创建方法索引(AI)。结果表明,HAT及其指数AI足够敏感,能够检测猪在轻度TBI(mTBI)后行为的轻度和暂时性变化。此外,尽管特定的行为结果取决于房屋,但使用 AI 可减少变异,并允许跨实验室进行一致的测量。此测试可靠且有效;HAT 可用于许多实验室和不同类型的伤害、疾病和危难的猪模型。此测试是为优化的手动时间戳方法开发的,以便观察者在每个样本上的花费始终不超过 9 分钟。

Introduction

尽管大脑中没有全球结构变化或明显的水肿,但人类mTBI通常被功能缺陷所定义。事实上,在一些mTBI患者中,这种损伤的特征是,在没有任何神经解剖学变化的情况下,他们的心理状态发生了变化。我们使用了mTBI6的猪模型,因为猪的大脑在解剖学和生理上都比啮齿动物7更接近人类,而相应的测量可以提供一组与人类相关的共同数据元素。

近年来,猪模型引起了神经创伤科学家和mTBI利益相关者对临床前研究的兴趣;然而,与TBI的啮齿动物模型不同,只有一些标准化的行为测试发布,允许评估实验室猪的情感状态(即心理状态)7,8,9, 10.我们的实验室的一个长期目标是开发几种互补的行为工具,这些工具足够敏感,能够测量猪何时经历亚临床疾病或动物处于病理前压力相关状态。

重复的行为测试,测量在实验室猪的情感状态的变化可能是区分具有前病理状况的动物和健康动物的良好候选者。例如,在商业生猪生产中使用笔内HAT,帮助农民选择性情良好的健康猪,或修改管理和住房策略,造成痛苦、伤害和疾病11、12。这些测试用于量化一头猪或一组猪的动机和整体情感状态。

我们的实验室和其他研究人员通过量化三类行为来测量猪的动机:1)通过非营养性口腔行为(NNOB)表达的探索性状态,即猪用嘴、鼻涕或面部嗅觉、舔、咀嚼、根基材,或无基板14、15的基板;2) 猪与物体的空间关系或16;3)鼻子方向,这是使用代替眼睛接触,因为猪有单目17,但近视视力,他们优先考虑他们的嗅觉比视觉18。如果一个健康的猪将人类与有益的刺激联系在一起,它们就会表达出高频率的NNOB,将鼻子指向人类,并寻求更接近人类11,16。然而,在生病、受伤或痛苦的经历之后,寻求甚至愉悦刺激的动机就会减少,因此,这些可衡量的行为可能会减少19。猪行为研究人员指出,在猪的家庭环境中,缺乏体验愉悦刺激的动机,在猪体内是可识别的,也是可测量的。因此,重复的HATs(治疗前后)可以作为一种敏感措施,区分用亚结对mTBI治疗的实验室猪与假治疗(仅麻醉)受试者。安赫多尼亚是一个情感状态,TBI患者可能经历21。此处使用的 HAT 具有帮助简化行为发现从动物模型到临床工作的翻译的潜力。在实验过程中,每天可以施用HAT,这也有助于规范实验室猪的护理,优化动物福利和畜牧业。

在这里,使用HAT,对迷你猪中mTBI产生的行为差异进行了探讨。通过利用HAT的非侵入性措施,让猪适应他们的家庭笔,日常管理和日常治疗,可以最大限度地减少行为变异。传统上,测试竞技场用于测量行为(例如,开场测试)。在空间有限的实验室中,笔内测试非常有用。在测试区域移动和处理猪可能会导致压力响应(痛苦或压力),并可能增加对测试响应的变化。笔内测试可移除该处理组件,因此可能会减少处理应力17的变异。出于上述原因,我们为此 mTBI 模型开发了每日笔内 HAT。

正确界定动物情感状态的标准化和量化措施是开发新的行为测试的重要方面。此外,测试应在多个实验室中重复。在这里,为了开发该协议,HAT在三个实验室的不同外壳系统中进行了测试。创建了三个子线图,以从示例视频中标记特定行为。接下来,创建了一个加权公式,以合并三个内型图,并允许在多个实验室中使用HAT。虽然此测试是专门开发和用于用亚结节 mTBI 治疗的迷你猪,但此处开发的方法和协议将具有区分亚临床受伤/生病或受困猪与健康的猪。

行为结果可能受单一与组住房、自由空间允许、使用的地板类型、使用的围栏类型、进给和水的位置、排便区域和环境富集位置的影响。因此,对三种住房类型进行了检查(图1):A类住房在堪萨斯州立大学(堪萨斯州曼哈顿);住房类型B和C在弗吉尼亚理工大学(阿灵顿,弗吉尼亚州)。每个地点的个别机构动物护理和使用委员会(IACUC)都批准了设施和程序的使用。

用于开发住房类型 A 的内周图 (图 1A),明尼苏达州交叉迷你猪 (野猪 = 7, 镀金 = 1;国家生猪研究资源中心,哥伦比亚,MO;年龄 = 25.6 = 3.66 [平均 = 标准偏差 (SD)] 周)被安置在室内,采用单笔,地板适合动物(IACUC #3881)。用于此协议的猪健康状况良好,没有应用治疗方法。为了开发B型住房协议,尤卡坦迷你猪(年龄= 25.3 × 2.80周[平均= SD]在弗吉尼亚理工大学设施(IACUC #15-060)是单体住宅(图1B)。动物治疗在其他地方描述29,包括诱导亚结节mTBI使用爆炸波过压或假控制(仅麻醉)。为了开发住房C型的协议,五只雌性哥廷根迷你猪(年龄=23.7~1.18周[平均[SD])在弗吉尼亚理工大学用一支大笔成对安置(图1C;IACUC #15-060)。前两个住房环境是典型的实验室住房或包含单一住房的猪。C型住房是一种非典型住房环境,可以容纳两头或两只以上的猪,而且可能比标准实验室住房更丰富。如果遵循以下方法,则可以跨外壳类型使用此协议。

Protocol

每个地点(堪萨斯州立大学和弗吉尼亚理工大学)的单独 IACUC 都批准了设施和程序的使用。 1. 相机和笔的设置和常规的建立 在将动物放入笔中之前,请将相机以 90° 角固定在每支笔上(请参阅建议的相机系统的材料表)。 在研究期间或仅在测试期间以 30 帧/秒 (fps) 连续记录动物。 用螺栓和链子固定碗、水器、垫子和玩具。 将连续播放白色或粉红色噪音(例如瀑布声)的音响机放置在猪舍内。注:外部突然噪音(例如,门打开和关闭)在会议23、24期间会导致突然反射。 在设施内用笔随机化或分层处理。 建立既定的畜牧业常规。这将有助于猪知道什么时候期望人类清洁笔,饲料和处理它们,并执行测试。 使用熟悉的治疗,让猪与人类联系在一起的奖励。 在奖励期间使用点击器,允许猪将点击声音与奖励相关联。不要使用发声和视觉信号来使猪熟悉奖励(见材料表)。 在早饭前或为喂猪投放新饲料之前,进行会议。 2. 猪的识别 使主题在视频源上可识别,即使它们是单一存储的。 确保观察者对治疗保持盲目,并在时间戳期间使用与治疗无关的标记系统保持公正。使用粘附在特定颜色、圆形和图案的胶带条上的医疗级胶带(见材料表)。 使用一个圆形补丁来标记猪的顶部和每侧一个向下(参见图1,绿色和蓝色标记)。 在胶带角上涂抹粘附水泥(小于 0.35 g),以帮助延长粘附寿命。注:太多的标签水泥不会很快干燥,导致胶带过早脱落。 在适应期间对标记策略进行故障排除和定制,以便高效执行官方测试,而不会给猪带来额外的压力。 使用数据收集表跟踪标记和主题标识(有关示例数据表,请参阅补充文件1)。注:要取出胶带,请勿撕下胶带,因为如果拉出任何头发,会导致疼痛。它要么可以自己脱落,水性润滑剂可以帮助将其驱离,也可以用剪子把它剪掉。如果磁带在不需要的时间脱落,请准备额外的标记胶带,并在猪吃一顿饭时重新涂抹,而不是限制猪。 3. HAT 会话 每次进行训练时,都要让测试人员戴同一顶帽子、帽子、靴子、气味等。 每天进行治疗,至少3次,然后,然后,在治疗后每天进行。 在开始会话之前,猪可以在笔中的任何区域。要开始会话,请测试者将款待放在碗中或笔前,然后单击单击 3x。 测试者需要把手从猪的视线中伸出来,在测试过程中保持静止。让另一位研究人员在数据表上标记会话的开始,然后启动计时器。120后,研究人员默默地向测试人发出信号,要求进入下一个科目并重新启动测试。 4. 建立HAT软件图 使用专用软件在一个项目下构建内周图(参见图1和图2以及补充视频1)。注:空间行为是动物相对于人类的位置。在透像图中,空间关系必须根据动物的笔进行定制,并在每次使用新颖的笔组时发布(图1)。在此类别中,行为被视为互斥。空间分为四个区域,方法级别不同(图1)。这些区域是跨住房类型的标准化区域。最近或攀爬(Cl)意味着猪可以爬上栅栏,以接近人类;因此,攀岩被认为是一种空间行为,表明猪最积极地寻求人类接触。关闭(Co)表示人类61厘米以内的区域。中 (M) 是距离人类 61-122 厘米以内的区域。远 (F) 是 123 厘米或以上的面积从人类。 结构行为侧重于整个身体或身体部位的方向(图2)。创建两个结构类别:1) 猪鼻位置和 2) 猪的活动状态。使用图2A识别方向性(方向1表示猪的鼻子朝向人类;方向2表示猪将鼻子指向人类)。 将活动行为(图 2B)划分为三种互斥的方法状态:NNOB、在没有 NNOB 的情况下站立或行走,在没有 NNOB 的情况下休息(请参阅视频中的内周图中的颜色编码)。注:NNOB 用于描述猪何时用嘴、鼻涕或面部来舔、嗅、咀嚼、咬、摩擦或根上非营养性物体,以寻找熟悉或新颖的机会。因此,当它处于这种活动状态时,它对人类感兴趣,并且处于接近状态。如果以 90° 角使用架空摄像头,则猪的鼻子位置和头部移动是 NNOB 的指示器。偶尔,猪会咬人或打假;鼻子可以看到,但头部上下移动。在没有NNOB的情况下站立或行走用于描述当猪处于直立位置时,头部静止不动,鼻子没有接触基板或乔打,这意味着它处于接近状态较小。没有NNOB的休息用于描述猪通过躺着或坐着休息时,这是这类行为下最不接近的状态。 5. 视频的时戳,提高效率和可靠性 根据数据收集器录制的开始时间,将素材编辑成精确的 3 分钟会话。时间戳方法每会话需要 9 分钟。 最多使用两个经过训练的观察人员来标记视频。注:如果使用两个观察者,则在观察者对相同的样本视频进行时间戳后,应量化、评估、调整观察者内部变异,然后报告为 Pearson 相关系数(有关方法,请参阅 Martin 和贝特森25。 将播放速度设置为 1 倍常规速度(即 30 fps)。不要逐帧暂停、倒带或时间戳。 分别对每一类互斥行为进行时间戳。 时间戳空间行为。重新启动视频。 时间戳结构行为。重新启动视频。 结构/鼻子位置行为的时间戳。 使用每个行为结果的持续时间(请参阅补充视频 2和3) 来汇总数据。持续时间测量需要转换为每个类别的时间百分比。 6. 方法索引 应用公式(图3),使每个结构和空间行为相结合,以创建一个AI(图3,图4)。除了以数字(图5)或表格形式分别报告行为和类别外,AI 还用于使用 AI。注:有关软件详细信息,请参阅材料表。在每个类别中,行为持续时间首先转换为百分比(行为持续时间除以测试会话的总持续时间)。每个行为都根据方法级别进行加权 (图 3)。回避行为(在远区域,休息,鼻子转远的时间百分比乘以0。中等方法行为(中间区域的时间百分比,转向人类,静止不动)乘以 1。方法行为的最大级别(近部和最近区域中的时间百分比以及显示 NNOB 的时间百分比)乘以 2。然后,每个类别分别对空间、鼻子方向和活动进行 3、2 和 1 的加权。应用常量 (0.10) 以创建百分比刻度。例如,如果猪面对人类,位于接近/最近区域,并在整个测试会话期间执行 NNOB,请注意 AI 为 100%(图 3中的红色猪 )。相反,如果猪在遥远的区域,不面对人类,并在整个测试过程中保持静止位置,则 AI 为 0%(图 3中的黑猪)。封闭区域的猪,如果远离人类,仍然站立着头(图3中的橙色猪),则可以与在中间区域执行NNOB的猪具有相同的AI。

Representative Results

三种外壳类型(A、B和C;见图1)用于三个不同的HAT实验室。 结构行为类别和头部和身体取向用于所有实验室和实验中的HAT,如图2所示。表 1显示了从 HAT 期间从预处理的健康猪获得的数据从所有三种住房类型和描述性统计信息中收集的数据。接下来,开发了一个公式,从在 HAT 期间获得的数据中计算 AI(参见图 3)。结果表明,在收集的数据中,使用AI减少了变异(表1)。这是一个重要的发现,因为较少的可变数据将允许使用实验较少的动物来检测较小的差异。 对于表1,使用PROC UNIVARIATE程序获得描述性统计数据(有关特定软件信息,请参阅材料表)。为了比较每个实验室的外壳类型行为的结果,使用了 MIXED 过程和重复度量模型。猪被当作随机变量处理。选择一阶自动回归类型作为协方差结构。使用图基-克拉默调整方法分离最小平方均值。显著性定义为P = 0.05。 接下来,确定 HAT 的每个测试会话都应使用同一人或不同的人类实验者。为了将不熟悉的行为响应与熟悉的响应进行比较,使用了与重复度量模型的 MIXED 过程。猪被当作随机变量处理。选择一阶自动回归类型作为协方差结构。使用图基-克拉默调整方法分离最小平方均值。显著性定义为P = 0.05。我们发现,当使用熟悉的人与在测试期间使用不熟悉的人相比,AI没有区别(参见表2中的数据)。如果猪从未与人有任何不良的相互作用,它们通常将所有人与食物积极地概括和关联起来。 HAT协议的适应期是从A型(336次测试会话)中猪的接近指数确定的。HAT 从到达后的第 8 天开始,由熟悉的人(他们上周处理猪)和不熟悉的人(以前与猪没有接触过)执行两次。为了确定时间对 HAT 结果的影响,使用了具有重复度量模型的 MIXED 过程。猪被当作随机变量处理。选择一阶自动回归类型作为协方差结构。使用图基-克拉默调整方法分离最小平方均值。显著性定义为P = 0.05。如上所述,数据没有检测到熟悉或不熟悉的人类接触的反应之间的差异(表2)。但是,适应期基于第 9 天、第 11 天和第 13 天显示的 AIs 明显低于所有其他天数来确定。适应后,基线应至少包括三个测量值,但我们建议在模型中计算六个会话作为协变量的 AI 均值。 为了确定HAT方法能否区分MTBI处理的猪和假处理的猪,HAT数据从12头猪1天前(-1)和3天后,他们治疗后,要么麻醉29(sham)或麻醉和爆炸波暴露使用冲击波管29到峰值 psi 47.4 × 13.6 SD 的长度为 4.7 × 0.9 ms SD(爆炸)。在统计软件程序中使用混合模型过程对受限制的可能性ANOVA进行分析。此分析确定了治疗、时间和相互作用之间的差异。报告模型中的最大 SEM,P < 0.05 被视为重要。 AI 包含所有行为 (图 3)。在治疗后的第 1 天和第 2 天,AI 测量区分 mTBI 猪与假猪(P < 0.05;图 4.行为可以在相互排斥的类别中进行分析和呈现 (图 5)。接近空间行为测量区分爆炸猪与假猪在治疗后的第1天和第2天(P <0.05;图 5A.同样,鼻子方向、休息时间和NNOB测量在治疗后的第1天和第2天区分假猪和爆炸猪(图5B和5C)。 图1:三种不同实验室外壳类型行为的空间类别。内周图是相对于人(脚印)和猪大小与可用空间量的关系而建立的。对于这类行为,最大的方法是当猪试图爬上最接近人类的面板(Cl;最近或爬升)。当猪的耳朵或更多位于这些空间区域时,经过训练的观察者时间戳”接近”(Co;0-61 厘米,距人类0-61厘米)、”中”(M;61-122厘米,距人类61-122厘米)和”远”(F;距人类123厘米)。每个实验室的钢笔都装有一两个碗,每天两次喂食,浇水(W)和一个玩具。(A) 每只50公斤的野猪是单体190厘米×114厘米的笔,地板磨碎。(B) 每只50公斤的野猪被安置在一个黑色垫子上,地板碎碎,笔后面有排水管。(C) 约10公斤的野猪用274×366厘米的钢笔成对,有混凝土地板、垫子、排水沟、固定碗和玩具。色带(例如绿色和蓝色)表示标记策略。图中的所有猪都标有绿色或蓝色补丁,作为视频上标记和识别猪的示例。请点击此处查看此图的较大版本。 图2:所有三个实验室和实验中采用的结构行为类别。(A) 对于头部方向类别,猪朝向或远离人或移动物体。(B) 对于身体取向类别,猪头或向下,进行非营养性口腔行为(NNOB);直立,站立或行走,但头部不移动或向下;处于休息状态,包括坐着或躺下。请点击此处查看此图的较大版本。 图3:方法索引公式和图表。方法索引旨在将所有行为组合置于 0 到 100 的尺度上,0 为处于最小接近状态的猪(在远端,鼻子转开,头部静止)和 100 在接近部分,鼻子指向人类,执行NNOB。软件程序(有关详细信息,请参阅材料表)用于测量行为,以便它们线性对齐。每个 Pig 结构表示从每个类别线性对齐的数据点。在每个类别中,行为持续时间首先转换为百分比(行为持续时间除以测试会话的总持续时间)。然后,根据方法级别对每个行为进行加权。回避行为(在远区域、休息、鼻子转远时的时间百分比)乘以 0。适度的方法行为(中间区域的时间百分比,转向人类,仍然站立头部)乘以1。方法行为的最大级别(近部和最近区域中的时间百分比,执行 NNOB)乘以 2。然后,每个类别分别对空间、鼻子方向和活动进行 3、2 和 1 的加权。应用常量 (0.10) 以在 0 到 100% 的完整范围内缩放数据。类似热图的配色方案用于表示最接近状态的猪与最小接近状态(黑色)中的猪。请点击此处查看此图的较大版本。 图4:经爆炸波照射处理的猪的接近指数。下图显示了猪在(-1)前1天和仅接受麻醉治疗后3天(sham,n = 6)或麻醉和爆炸波暴露于47.4± 13.6 SD的峰值psi,长度为4.7~ 0.9 msSD。错误栏表示 SEM。用于治疗的P值 = 0.032,用于时间 = 0.033,用于治疗的 P 值 x 时间 = 0.012。在统计软件程序中使用混合模型过程对受限制的可能性ANOVA进行分析。此分析确定了治疗、时间和相互作用之间的差异。报告模型中的最大 SEM,并且 =P < 0.05 被视为重要。请点击此处查看此图的较大版本。 图 5:显示行为的堆叠条形方法。这些面板显示一种堆叠棒方法,用于显示 (A) 空间行为、 (B) 鼻子方向和 (C) 猪的活动前 1 天 (-1) 和 3 天后,他们只接受麻醉治疗 (sham, n• 6) 或麻醉加上爆炸波暴露于 47.4 ± 13.6 SD 的峰值 psi,长度为 4.7 × 0.9 ms SD. 外壳类型 B 用于此实验。所有互斥行为都可以在每个堆叠条形图中表示。(A) 空间行为的处理 x 时间P-值远 = 0.060,中间 = 0.110,[关闭 = 0.014,最近 = 0.557;关闭 = 0.014;接近 = 0.557;接近 = 0.557;接近 = 0.060;接近 = 0.557(B) 治疗 x 时间P- 鼻子方向的值为 [lt; 0.001];(C) 活动的处理 x 时间P- 值为 > 0.10;治疗P值为休息 = 0.046,支架 = 0.584,和 #NNOB = 0.042。集合的SE是 (A) 7.5%, (B) 9.6%, 和 (C) 9.7%.每个行为结果都由受限的可能性 ANOVA 分析,使用统计软件程序中的混合模型过程(参见特定程序的材料表),然后合并在图表中。分析确定了治疗、时间和相互作用之间的差异。报告模型中的最大 SEM,并且 =P < 0.05 被视为重要。请点击此处查看此图的较大版本。 跨住房类型的 ANOVA 统计信息 所有健康猪数据的描述性统计信息 不。实验单位 外壳类型 P- 大声 笑 分位数,% 从控制1中检测 ±% A B C Sem 值 Obs。 Μ Sd 简历百分比 Sem 最小 25 50 75 麦克斯 25 50 75 100 200 方法索引,% 75.4 69.2 76.6 5.5 0.318 288 74 17 23 1 0 70 80 84 99 18 4 3 3 3 笔位置持续时间,% 远 8.5a 5.3a 23.0b 4.8 0.008 288 10 20 200.1 1.2 0 0 0 10 100 — 336 149 84 21 中档 18.9 46 13.75 16.2 0.066 288 23 29 125 1.7 0 2 10 32 100 526 131 58 33 8 关闭 72.4a 43.9b 62.4a 12.8 0.032 288 23 29 123.9 1.7 0 47 78 93 100 509 127 57 32 8 最近(爬坡) 0 8.9 0 3.1 0.001 288 67 32 47.8 1.9 0 46 80 95 100 74 19 8 5 3 关闭 = 最近 72.5 53 62.3 14.9 0.311 288 68 32 46.6 1.9 0 46 78 93 100 74 19 8 5 3 活动持续时间,% 谎言/坐脑静 5.6a 0.0b 17.0c 1.8 0.001 288 1.3 5 393.7 0.3 0 1 3 7 59 — — 579 326 82 站立/行走,头部静止 48.3a 63.6a,b 83.5b 10 0.006 288 52 43 82.1 2.5 1 7 47 100 100 226 57 25 14 4 国家 81.5 57.7 71.1 13.3 0.109 288 77 28 36.4 1.7 0 66 91 98 100 44 11 5 3 3 头部方向、持续时间、% 离开 24.7a 17.4a 50.7b 4.5 0.001 288 26 21 79.3 1.2 0 10 22 39 92 212 53 24 13 3 对 75.3 a 82.6 a 49.3 b 4.5 0.001 288 74 21 27.8 1.2 8 62 79 90 100 26 6 3 3 3 表 1:检查了所有外壳类型的基线 HAT 测量值,以创建此数据集。行为结果通过限制的可能性ANOVA使用统计分析软件的MIXED过程进行分析。这些分析确定了每种实验室外壳类型的行为持续时间和方法指数之间的差异。报告模型中的最大 SEM,P < 0.05 被视为重要。 此外,统计分析软件的UNIVARIATE程序用于描述性统计。然后,将置信度 (CV) % 输入实验单元计算器27,并检查两种治疗之间的预期差异的条件。 治疗 P 值 熟悉 陌生 Sem Trt 时间 TRT=时间 方法索引,% 84.8 84.4 3.06 0.766 0.002 0.661 笔位置持续时间,% 远 10.7 10.1 3.49 0.844 0.008 0.522 中档 18.7 17.6 3.38 0.717 0.014 0.918 关闭 70.4 72.3 5.25 0.617 <0.001 0.895 活动持续时间,% 撒谎或坐,没有NNOB 5.8 5.8 0.8 0.995 <0.001 0.901 站立或行走,无 NNOB 5.5 5.5 1.4 0.995 <0.001 0.524 国家 82.1 83.3 4.12 0.722 0.0029 0.617 头部方向、持续时间、% 离开 23.9 23 2.81 0.725 <0.001 0.329 对 76.1 77 2.8 0.725 <0.001 0.329 表2:对A型房屋中的七头猪进行了实验。每天举行两次会议。对于每个会话,一个熟悉的(女性)或七个(三男四女)不熟悉的人之一在HATs中使用。同一个熟悉的人先走了,用了七个不熟悉的人。对统计分析软件的ANOVA模型进行了检查,检查其处理(熟悉或不熟悉)、时间(天)及其相互作用。 补充视频1:带有字幕的观察者软件设置。请点击此处下载此文件。 补充视频 2:带字幕的数据导出。请点击此处下载此文件。 补充视频3:带字幕的数据分析。请点击此处下载此文件。 补充文件 1:数据收集表示例。请点击此处下载此文件。

Discussion

轻度损伤的大脑,不导致显着的解剖学和结构变化,可检测与最先进的成像可能难以识别和治疗28。然而,mTBI患者特别容易受到额外的侮辱,这些侮辱会对大脑造成重大损害,因此,识别这一人群非常重要。在mTBI的迷你猪模型中开发的行为测试与人类mTBI患者特别相关,因为猪的生理与人类相似,并且表达类似的情感状态,如8、9、10 ,20.在这里,我们开发了一个非侵入性的笔内行为测试(HAT),并表明它足够敏感,能够区分mTBI猪和假猪。此外,为在 HAT 期间观察到的行为开发了加权索引(AI),这些行为在住房和猪类型中普遍存在。

修改和故障排除:

HAT 的方法基于环境学指南25和若干试错策略建立,以提高测试6的可靠性、可重复性和有效性。可靠性度量有助于确定测试的优点和局限性。可靠性定义了测量的可重复性和一致性,并且没有随机误差的程度28,29。我们之前已经报告了 HAT 的内观察者和观察者间的可靠性,并且随着额外的结构内型,在持续时间6中,可靠性同样高(皮尔森的 R2 > 0.90)。频率和延迟测量需要经过训练的观察者,而持续时间测量较少依赖于观察者,因此,在实验室30中更可靠。

实验室内的可靠性和实验室之间的可重复性取决于方法。在我们的实验室中,视频系统不断录制,文件最初存储为 5 分钟文件,一些 HAT 会话发生在两个文件中。当使用数据表的精确时间来剪辑和合并视频时,错误更少。在开发内周图之前,允许观察者暂停、停止和倒带视频素材,以标记整个内周图中的所有行为。该方法不仅造成每个样本的时间戳变化,从3分钟到20分钟不等,而且对于大多数行为来说,观察者之间的和观察者内的可靠性也较差。因此,我们设置播放速度,并让观察器一次对每个类别进行时间戳。因此,当可靠性仅属于一个类别时,观察者在同时查阅定义和素材后,会独立地重新标记该类别,而不是整个内周图。设置的播放和类别方法允许一致预测每个样本需要时间来加时。对于超过一个月的项目,对编码视频和观察者内可靠性进行例行审查非常重要。

降低可靠性和可重复性的另一个因素是视频设置。最初,使用手持相机和三脚架,从笔移到笔。当使用这种方法时,猪需要在HAT之前被引入到三脚架和相机中;否则,猪似乎对三脚架和运动的反应比测试人多。此外,非顶置摄像机角度限制了在时间戳期间观察的观察者的视角,空间深度感知增加了空间行为测量中观察者内部和之间的变化;因此,我们开发了固定摄像头的协议。使用此方法时,需要格外小心,以确保在每次测试之前正确放置摄像机,并且需要在每个 Pig 会话之间的设置中留出更多时间。但是,我们了解到,连续视频开销系统需要在第一个 HAT 之前至少 24 小时午夜开始初始录制。许多视频系统的时间戳显示不准确,并且与帧同步;因此,我们不再依赖显示时间。午夜开始允许进行精确的帧捕获和视频编辑,并且未使用时间戳显示。

此外,在排除此测试的故障时,猪的适应和设置例程非常重要。在猪的录像中,它们不适应他们的环境,在HAT期间观察到起搏。这是一个指标,猪可能处于激动状态31,而不是在探索状态32。三周或更长时间的适应期可能会减少实验中速度的猪的数量。但是,如果在整个采样期间持续起搏,则可能需要调整此内周图,以包括行走和静止不动。

有效性是度量表示所提问问题的预期范围的程度25。刚开发HAT时,我们只使用了空间内周图。空间内周图行为的定义准确而具体地描述了与人类主体的接近程度,它们直接告诉观察者猪在它们自己和人类之间留下了多少空间。然而,一旦这些方法需要应用于新的实验室设置,我们认识到空间内周图是实验室特有的。笔尺寸和其他物体的位置会影响空间内周图的结果;因此,如果笔设置之前未报告,则需要发布包含笔的测量值和细节的图表。除了报告笔环境外,结构行为还添加到了内周图中。与空间行为不同,结构行为在实验室中可以更容易地进行评估;这些行为之所以有效,是因为它们具体地描述了猪的活动状态水平。当猪休息时,它很可能没有接近的动机,并且无法改变立场,以像站立的猪一样快速接近。类似地,显示NNOB的猪处于探索状态,但站立时头部静止的猪更有可能处于催化状态。鼻子定向有助于有效,因为鼻子、耳朵和眼睛是猪用来收集人类信息的东西。

技术的限制:

这种技术的一个潜在问题是猪对测试人类的反应的变异性。此外,猪会看着测试人的手,这可能导致这个人无意的提示。因此,通过实验测试1)猪对熟悉的人类和不熟悉的人的反应,以及2)标准化,在颗粒被丢弃后,测试人静止不动,并把他们的手从猪的视线。数据显示,在HAT期间没有治疗或治疗x时差(表2),表明HAT可以由熟悉或不熟悉的人管理。其他研究人员建议,猪倾向于根据以前的相互作用11,12,13来概括人类;因此,猪以前与人类的经历需要是积极的。这一挑战也可以通过警惕的实验设计来补救;对于每个区块,需要为每次利息处理提供足够的实验单元。

在这项研究中,虽然只有两个有经验的观察者对所有三种住房类型的所有视频进行时间戳,但特定行为结果的住房类型之间存在差异(表1)。例如,住房类型 B 中的猪比住房类型 A 和 C 中的猪更频繁地进入最近区域。这可能是由于笔材料的差异;在B型住房中,笔的前部是一个链状门,带有水平条,允许猪在HAT期间爬上大门。另一方面,A型和C型的外壳有垂直条形,水平表面较少,供猪攀爬。这种可变性可以通过在接近和最近区域的持续时间花费,然后比较不同住房类型的持续时间来补救(表1;P > 0.10)。然而,C类房屋中的猪在较远地区逗留的时间,较A类及B类房屋为多(表1;P < 0.05),这可能是由于将水器放在笔的后面,而不是笔的前面。如果实验室选择标准化水器、碗和玩具的放置,并确保它们固定,以便猪不会将物体移到其他区域,则可以纠正这一限制。

此测试对于所有类型的实验室都有很大的可访问性,但是,如前所述,手动盖章的空间内周图和测量在不同实验室之间将变化更大。尽管如此,身体和头部结构的中长线图无处不在。能够对猪进行经过验证的自动跟踪的实验室可能会通过自动跟踪空间内周图而不是手动跟踪而受益,因为移动的距离和移动速率可能是行为测量的附加结果。帽子。通过调整 AI 公式,可以弥补笔内设置和传统技术(而不是测试区域和自动跟踪技术)的限制。AI 提供标准化的测量和术语,用于个体猪如何使用笔空间并表达对人类的兴趣。这种计算,派生自常见的行为测量,是敏感的猪模型的亚结节mTBI,并可能,其他状态的亚临床损伤或疾病。此外,AI 可减少实验过程中的随机变化,并且与依赖更多特定于实验的测量方法相比,在实验和实验室之间可能更容易进行比较。结构行为为此公式提供了基础,因为这些行为是跨处理的标准测量,而空间行为取决于笔设置、笔中的猪数和跟踪系统。例如,我们观察到,当两只健康的猪在一支笔中测试时,它们会通过一起接近来执行类似的空间行为,但跟随第一只的猪可能更多地将鼻子朝向笔伴侣,而不是向人类方向,并表达更多的NNOB,因为猪谁领导作为哨兵。尽管如此,AI 有助于减少这种变化,即使从配对行为。

尽管人工智能是跨实验室标准化测试的优秀工具集,但研究人员可能仍希望检查实验室或实验中的测试特定行为结果,特别是如果它们有足够的能力(即实验单元和重复测试)。)。因此,此处包含表 1,其中包含所有行为结果、方差、分布以及每个特定行为的动物数量的计算检验。例如,如果研究人员有笔环境,允许猪在HAT期间持续攀爬,并且他们知道他们的治疗导致超过75%的攀爬行为差异,那么他们就可以根据测得的方差来证明动物数量的合理性。如果新行为被添加到内周图中,科学家将需要证明哪些行为是方法或退出的指示,然后再将它们纳入索引。例如,如果大多数动物在实验步速沿笔壁(即,thigmotaxis)32,这种行为的持续时间可以纳入身体结构内周图类别。行为可以在详细的堆叠条形图(即图5)或表格形式中表示,然后,在应用索引计算之前,可以采用静止状态进行总结。因此,AI 可以表示在实验室中普遍存在的行为,但其他独特的行为仍可以单独表示。

相对于现有方法的重要性:

现有的HAT方法为商业农场的猪建立了评估动物福利的方法。在这里,实验室猪已经建立了一个协议,可以帮助研究人员评估动物福利,并区分mTBI猪和假处理猪。另一种传统测试可能是使用开放字段测试。这个测试以前用来评估猪的情绪和福利33。露天测试最初旨在通过测量啮齿动物对开放空间和光线的自然厌恶来测试它们的情感状态。相反,健康的猪可能认为同样的刺激,在生病,受伤,或压力治疗后,他们可能表达恐惧。这种测试需要更多的实验室空间,并且需要猪适应被处理和放置在一个露天竞技场。如果实验室有处理猪的空间和协议到位,重复的HAT会话,除了一个露天测试,可能有助于进一步区分处理动物和假处理的动物。

《议定书》内的关键步骤:

协议中的前三个步骤对于 HAT 措施的成功最为关键。每头猪的会话只需 3 分钟;然而,充分的准备将有助于使这个测试可靠。如上所述,摄像机位置和录制设置对于清晰度和复制至关重要。相机角度不当会限制观察者的视野,从而增加测量误差。另一个经常被忽视的步骤是固定笔中的对象。猪会移动未固定的物体,这可能会影响它接近人类的动机。设置和管理系统很重要,因为猪需要适应他们的环境,然后才能持续执行测试。猪,如果不太适应他们的家庭笔或日常或遇到压力,将排便在其他地区,而不是在笔34的背面。排便区可能会影响他们接近的动机。从摄像机的视角来看,观察者应该能够识别单个猪;然而,重要的是,标记方案没有提供有关动物治疗的信息,因为这将偏向观察者25。

识别猪对于获得正确的猪的正确行为数据非常重要,即使它们是单一饲养的。猪经常被移动进行治疗,并且标记使观察者重新确认,在猪被移除并放回笔中后,他们正在观察同一头猪。猪可以成对安置,如在住房类型C,因此,它变得非常重要,以确定猪。牲畜标记油漆和标记需要日常应用;因此,该协议要求使用医疗级胶带和标记水泥的涂抹。胶带最适合长头发的猪。短发和皮肤干燥的猪比头发较长的猪更频繁地从胶带上脱落。

未来应用:

总之,此处描述的非侵入性笔内 HAT 测试足够敏感,能够检测 mTBI 后猪的轻度和时间相关变化。此外,我们开发了一个加权指数,称为AI,以评估不同笔型和不同类型猪的猪的变化。虽然 HAT 已用于检测暴露于 mTBI 的猪的变化,但此行为测试可用于检测经历压力或病理前状况的动物的可测量行为变化。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢海军研究办公室(格兰特#12166253)的资助。此外,作者衷心感谢动物护理人员、兽医以及堪萨斯州立大学和弗吉尼亚理工大学的学生在动物工作期间给予的支持。作者还要感谢娜迪格·克雷布斯的技术援助,感谢谢尔比·楼梯、莎拉·格林威和米凯拉·戈林的技术援助和额外的动物护理。

Materials

Dome 3.0 Megapixel Cameras with 2.8-12mm lens set between 2.8-3.2 mm Points North Surveillance, Auburn, ME CDL7233S Lower mm lenses are needed for low-profile pens
Manfrotto 244 friction arm kit B&H Photo B&H # MA244; MFR # 244 To mount and secure cameras at a 90 degree angle
Video Recording System Points North Surveillance, Auburn, ME NVR-RACK64 NVR is customized
Colored and patterned duct tape attached to a double-sided medical grade tape  MBK Tape Solutions, Chatsworth, CA 3M 1522H Sustainable marking of pigs
Approach Index Formula generator Dinasym, Manhattan, KS Approach Formula Company will customize macros for specific lab needs
Geovision Software Points North Surveillance, Auburn, ME Geovision Software to edit video time into 180 second clips
Clicker Petco Good2Go Dog Training Clicker
Reward treat (feed pellet, carob chip, raisin, marshmallow) Variable N/A Depending on previous exposure, adult pigs are very  neophobic when new food is introduced. Limit-fed pigs can be fed a few pellets of feed. 
Statistical Analysis System (SAS) SAS Institute, Cary, North Carolina SAS 9.0 Our laboratories preference for analyzing mixed models and repeated measures
Observer 11.5 software Noldus Information Technology, Leesburg, VA Observer 11.5 Software to manually timestamp video clips
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Hulbert, L. E., Bortoluzzi, E. M., Luo, Y., Mumm, J. M., Coffin, M. J., Becker, G. Y., Vandevord, P. J., McNeil, E. M., Walilko, T., Khaing, Z. Z., Zai, L. Noninvasive, In-pen Approach Test for Laboratory-housed Pigs. J. Vis. Exp. (148), e58597, doi:10.3791/58597 (2019).
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