كشف البلطي بحيرة الفيروسات باستخدام التقليدية RT-PCR وسيبر الأخضر RT-قبكر
Summary
هذا البروتوكول تشخيص “الفيروس بحيرة البلطي” (تيلف) في أنسجة البلطي استخدام منهجيات RT-PCR. ويرد وصف الأسلوب كامل من تشريح الأنسجة إلى مجموع استخراج الحمض النووي الريبي، تليها كدنا التوليف وكشف تيلف بكر التقليدية أو PCR الكمي دسدنا ملزمة صبغة فلورسنت ملزم باستخدام.
Abstract
والهدف من هذا الأسلوب لتسهيل كشف “الفيروس بحيرة البلطي” (تيلف) سريعة وحساسة ومحددة في الأنسجة البلطي. يمكن استخدام هذا البروتوكول كجزء من برامج المراقبة وتدابير السلامة البيولوجية في المختبرات البحثية الأساسية تيلف. معيار الذهب لتشخيص الفيروس عادة ما ينطوي على عزل الفيروس متبوعاً بتقنيات تكميلية مثل النسخ العكسي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) لمزيد من التحقق. وهذا يمكن أن تكون مرهقة، وتستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب عادة عينات الأنسجة بشكل كبير مصاب بالفيروس. استخدام الرايت-الكمية (q) PCR في الكشف عن الفيروسات مفيد بسبب طبيعته الكمية وحساسية عالية، وخصوصية، والتدرجية ووقتها السريع يؤدي إلى. هنا، يقوم الأسلوب الكامل من بكر النهج تيلف الكشف وصف، من البلطي جهاز تقطيع، مجموع الحمض النووي الريبي (الرنا) استخراج استخدام الحل ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيديوم، والكمي الجيش الملكي النيبالي، متبوعاً بكر خطوتين أنا صبغ تنطوي على البروتوكول، توليف مكملة الحمض الخلوي الصبغي (كدنا) وكشف تيلف بكر التقليدية أو تحديد الكمية عن طريق qPCR استخدام سيبر الخضراء. يتطلب خطوات بوست-بكر بكر التقليدية وستبلغ ببساطة عن وجود الفيروس. سوف تسمح للقياس الكمي المطلق تيلف وصولاً إلى أقل قدر 2 نسخ النهج الأخير واستثنائية وبالتالي مفيد لتشخيص تيلف في الحالات السريرية الفرعية. وصف مفصل للنهج بكر، نتائج تمثيلية من مختبرين اثنين ومناقشة مستفيضة للمعلمات حرجة على حد سواء قد أدرجت للتأكد من أن الباحثين ونفسيين العثور على الأكثر مناسبة وقابلة للتطبيق أسلوب للكشف عن تيلف.
Introduction
إمدادات الأسماك العالمية الفرد بلغ رقماً قياسياً جديداً 20 كجم في عام 2014، وكان هذا بسبب النمو القوى في تربية الأحياء المائية. الاستزراع المائي لا يزال واحداً من أسرع الأغذية الحيوانية القطاعات المنتجة في جميع أنحاء العالم، وهو قطاع الأغذية الحيوانية فقط المنتجة التي ينمو بوتيرة أسرع من السكان البشرية1. وتشمل سيتشيلدس تيلابييني ثاني أهم الأسماك المياه العذبة المستزرعة في جميع أنحاء العالم مع إجمالي إنتاج عالمي من 6.4 مليون طن (طن متري) وتقدر قيمتها ب9.8 بیلیون دولار أمريكي بحلول عام 20152. المنتجين العشرة الأوائل من البلطي هي الصين (1.78 مليون طن)، إندونيسيا (1.12 مليون طن) ومصر (0.88 طن متري)، متبوعاً ببنغلاديش، وفيتنام، والفلبين، والبرازيل وتايلند، وكولومبيا وأوغندا2. ومن المتوقع أن يكون إنتاج البلطي العالمي حوالي 7.3 مليون طن بحلول عام 20303. وقد أصبحت البلطي مثل هذا مصدر الغذائي عالمي هام ليس فقط لأنها مصدر رخيص للبروتين4 بل أيضا لأنها سهلة تولد في القدرة في إطار طائفة واسعة من المياه والمناخ الشروط5،6. عقود قليلة مضت، كان يعتقد أن هناك عدد قليل من الأمراض التي تهدد استزراع البلطي تجارياً كبيرا، لكن هذا لم يعد صحيحاً. هو مرض فيروسي ناشئة تسمى البلطي بحيرة فيروس المرض (تيلفد) العثور على أول وباء المرض الحرجة من أي وقت مضى في البلطي والصناعة برمتها في خطر. هذا المرض له عواقب اجتماعية-اقتصادية خطيرة، ويشكل تهديدا مباشرا على الأمن الغذائي للملايين من الناس في7من أفريقيا، آسيا وأمريكا الجنوبية. في بداية عام 2018، ذكرت “المنظمة العالمية” للصحة الحيوانية (OIE) أن وكيل المسببة لهذا المرض، تيلف، اكتشفت رسميا في ثلاث قارات تشمل ثمانية بلدان8 ونظرا لهذه البطاقة المعلومات الممرض تم تحديث هناك المزيد من التقارير من تيلف في تنزانيا، أوغندا9و10من إندونيسيا، تايوان11 وبيرو12. تيلف فيروس الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل رواية وصف ليكون فيروسات مثل أورثوميكسو لأنه يحتوي على مجموعة متنوعة من الخصائص تذكرنا أورثوميوكسوفيروسيس أخرى مثل الإنفلونزا أو المعدية السلمون فقر الدم الناجم عن الفيروس (إيساف)13. أنها المرة الأولى في أعقاب خسائر جسيمة في البلطي المستزرعة والبرية في “بحيرة طبرية، إسرائيل”14. وبعد ذلك، تفشي الأمراض المماثلة المشار إليها نفوق الصيف وشهر واحد متلازمة الوفيات المرتبطة بالإصابة تيلف أفيد في هجين البلطي الأحمر والبلطي النيلي (Oreochromis niloticus) في مصر15 والنيل (Oreochromis spp.) في16من تايلند، على التوالي. تاريخيا يجري الكشف عن فيروسات الحيوانات المائية بالنمو وعزل الفيروسات في خلية ثقافة. تم اختبار خطوط الخلايا المختلفة لإكثار والعزل بما في ذلك الخلايا E-11 المستمدة من الأفعى الأسماك (سترياتوس أوفيوسيفالوس)،من1718، مكتب الإدارة والميزانية، والتي تنشأ من Oreochromis TmB تيلف mossambicus18، وأونلب وأونل التي تنشأ من النيل البلطي (النيلي)19. في حين ثقافة الفيروس يتميز بأنه يقدم مادة لتجارب أخرى، فقد عيب فإنه يتطلب على الأقل 4-7 أيام لمراقبة تشكيل تأثيرات سيتوباثيك (CPE)، ومن الأهمية بمكان مختلف الفيروسات بيسسيني، التي أكثر ملاءمة تكرار قد يكون نشر وإنتاج CPE مماثلة.
في العقود القليلة الماضية، كان هناك الابتعاد عن طرق التشخيص التقليدية، وغالباً ما تستغرق وقتاً طويلاً مثل زراعة الخلايا، والأمصال والكشف عن مستضد واستبدالها ب اختبارات الحمض النووي أسرع وأكثر حساسية على أساس الكشف عن20، 21. وهذا واضح من حقيقة أن العديد من قبكر فحوصات قد وضعت كأساليب تشخيصية هامة للعديد من الأمراض الفيروسية في الحيوانات المائية، مثل إيساف22،23، فيروس تسمم الدم النزفية الفيروسية (فهسف)24 ،25، بيتانودافيروس،من2627 alphavirus السلمونيات28، والأسماك إيريدوفيروس29، أنجويليد هربس 1 (AngHV1)30، وليمفوسيستيس مرض فيروس (لكدف)31 . طرق قوية للتشخيص والممرض مراقبة هناك حاجة عاجلة الحد من انتشار تيلف. وينبغي أن تسمح هذه الأساليب الكشف المبكر عن الإصابة قبل وضع علامات سريرية والكشف عن الفيروس منخفضة الأحمال. وحتى الآن، بروتوكولات بكر مختلفة بما في ذلك14،RT-PCR32، وضعت متداخلة RT-PCR18وشبه متداخلة RT-PCR33RT-قبكر32،34 للكشف عن تيلف في أنسجة الأسماك. مقارنة لعزل RT-قبكر والفيروسات في خطوط الخلايا عرضه للكشف عن تيلف كشفت أن الرايت قبكر ألف مرة أكثر حساسية من عزل الفيروس32. على الرغم من أن كل بروتوكول PCR المنشورة قد ذكرت حساسيات مختلفة للكشف عن تيلف، معظم فحوصات حساسة للغاية مع حدود الكشف عن النسخ الفيروسية في 7.5 نسخ33, 7 نسخ18 أو 2 نسخ32 دولاراً رد فعل.
والهدف من هذه المقالة أساليب لشرح كيفية إجراء فحوصات الكشف عن تيلف، بدءاً بجمع الأنسجة البلطي، إلى مجموع استخراج الحمض النووي الريبي، كدنا التوليف، بالتفصيل، وثم بكر تيلف محددة على أساس فحوصات. على وجه التحديد، وقد وصف بروتوكولات شاملة سواء RT-PCR التقليدية وأيضا سيبر المستندة إلى الأخضر RT-qPCR لنداء إلى مجموعة واسعة من العلماء تهدف إلى الكشف عن تيلف. السابقة هو أقل حساسية ولكن عادة ما يكون هو خيار الكشف عن أرخص. الأخير يتطلب بنية تحتية أكثر تفصيلاً مثل جهاز PCR كمي والكاشفات أكثر تكلفة، ولكن لديها مزايا الكمية وسريعة وحساسة للغاية، بمعنى أنه يمكن استخدامه للكشف عن تيلف في الفرعية سريرياً الأسماك المصابة. RT-PCR والبروتوكولات الرايت قبكر أجريت في مختبرات مختلفة اثنين مع يعزل الجغرافية المتميزة تيلف وتسليط الضوء على النتائج شملت الحساسية وإمكانية تكرار نتائج لفحوصات الموصوفة هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
تيلف ذكر أولاً في عام 2014 في إسرائيل14 ومنذ ذلك الحين، تم التعرف عليه في العديد من البلدان بما فيها مصر، وكولومبيا، والهند، وماليزيا، وأوغندا وتنزانيا وتايلاند15،،من1618، 35 , 48-الوعي العالمي، خاصة، في البلطي البلدان المنتجة قد وضعت المزيد من الاهتمام على الفيروس ومختلف القيود وتدابير الرقابة من جانب السلطات الحكومية قد نفذت محاولة للحيلولة دون انتشار تيلف. هنا، فسر بروتوكول مفصل لكشف تيلف في الأنسجة البلطي، تشمل جمع العينات، وعزل الحمض النووي الريبي، كدنا فحوصات التوليف وبكر و qPCR. وهناك جوانب مختلفة لهذه الأساليب التي تستحق المناقشة محددة. تم التعرف على تيلف في الأسماك تمتد متنوعة أحجام9،،من1214،،من1549 ، وأنواع البلطي حتى الآن، بما في ذلك البلطي الهجين المستزرعة (o. النيلي × المذهبة O.)11،14، النيل البلطي (النيلي)9،،من1014،،من1516، 33 , 35 , 36 , 49 , 50 والأحمر البلطي (Oreochromis sp.)16،33،،من4851، كما جيدا كما هو الحال في البرية النيل البلطي9،12، أسود حددت البلطي51 وزيلي ت.14،15، س. جاليلايوس، O. المذهبة و انترميديا سيمونيس ت.14 ومؤخرا جداً تيلف في البرية الكارب (باربونيموس شوانينفيلدي)52. يمكن جمعها من البلطي صحية فضلا عن تحتضر بغض النظر عن السن أو الحجم أو الأنواع عينات الأنسجة من الأعضاء الداخلية (غيل، الطحال، الكبد، القلب، الكلي الرأس) أو مخاط37 وتجهيزها لعزل الحمض النووي الريبي. ويستخدم البروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي الإجمالية المبينة هنا حل أحادي الطور من ثيوسيانات الفينول وجوانيدينيوم، وعامل يشوه تشاوتروبيك. هي تجانس الأنسجة مباشرة في هذا الحل تليها إضافة كلوروفورم والطرد المركزي لتحقيق انفصال حيث يتم إنشاؤها الحمض النووي الريبي واضحة تتضمن المرحلة المائية العليا والطور البيني ومرحلة عضوية أقل. الجيش الملكي النيبالي معزولة من مرحلة مائي بترسيب الايزوبروبانول، متبوعاً بالغسيل من الجيش الملكي النيبالي المستردة للتخلص من الملوثات. كان رائدا بيوتر تشومكزينسكي وساكي نيكوليتا عزلة من الجيش الملكي النيبالي بهذه المنهجية وكان يشار جوانيدينيوم استخراج ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم53،54. هذا النوع من كاشف المستخدمة لاستخراج الحمض النووي الريبي يمكن شراؤها تجارياً أو المحرز في المختبر (انظر الجدول للمواد للحصول على مزيد من المعلومات). هذا البروتوكول وقتاً أطول قليلاً من الأساليب القائمة على عمود مثل تنقية القائم على السليكا، ولكن بشكل عام، أكثر فعالية من حيث التكلفة وغلة أكثر الجيش الملكي النيبالي.
في هذا البروتوكول، والتحديد الكمي للجيش الملكي النيبالي باستخدام قيم A260 ترد حيث كانت قيم يمكن أن تشير إلى نوعية الحمض النووي الريبي (A260/A280 = 1.9-2.1). في حين أن هذه الطريقة سوف تعطي مؤشرا جيدا لنقاء العينة، لا يمكن على الإطلاق إطلاع نوعية الجيش الملكي النيبالي المستخرجة. بشكل صحيح تحديد ما إذا كان الجيش الملكي النيبالي سليمة أو المتدهورة جزئيا، عينات يمكن فصل قبل [اغروس] هلام التفريد فيه تلطيخ أتبر الملون 18S وعصابات الرنا الريباسي 28S تشير إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي. وقد تشمل مزيد من التحقق من نوعية الجيش الملكي النيبالي باستخدام أداة مختبر على رقاقة. وعلاوة على ذلك، أيضا مهم لهضم الجيش الملكي النيبالي المنقي مع الدناز الأول لإزالة تلوث المضيف الحمض النووي، مما قد يؤدي إلى نتائج خاطئة استناداً إلى التطبيقات المتلقين للمعلومات. إذا هو تلويث جدنا المضيفة لا تزال عينة الحمض النووي الريبي إلى حد كبير، يمكن أيضا إجراء علاج دناسي إضافية في نهاية الإجراء استخراج الحمض النووي الريبي (انظر الجدول للمواد).
تركيب الدنا تكميلية يمكن أن تؤثر إلى حد كبير نتائج قبكر العامة وجانبا من الأسلوب الذي يمكن أن يعرض الاختلاف. يتضمن البروتوكول كدنا تدعو إلى هنا لإنشاء مكون واحد استخدام اليغو (dT) وهكذا فقط المحاضر مرناس المحتوية على ذيول بوليا. يسمح عنصر التحكم المستخدم للضبط المكونات التي تريد استخدامها في رد فعل النسخ العكسي، وهذا النمط من كدنا وتوليف أثبت نجاحه ل الكشف عن تيلف32. كبديل لهذا التشكيل هو مزيج الرئيسي اشترى تجارياً تحتوي على جميع العناصر اللازمة لرد فعل عكسي من النسخ وسريع جداً وبسيطة دون البروتوكول خطوة متعددة، بيبيتينج ودرجة الحرارة متعددة المعتادة. وهذا مفيد لأنه يقلل من مناولة ويعزز التوحيد عبر كافة العينات. وغالباً ما تشمل هذه الأصول الرأسمالية-يمزج oligo(dT) وكبسولة تفجير عشوائي يجعلها تنطبق على مختلف الحمض النووي الريبي قوالب وتوليد كدنا الممثل نسخاً من تسلسل من طول الكشف في عدد سكان (الفيروسية والبلطي استضافة مرناً) ومن الناحية النظرية، يمكن قياس كل أنواع الحمض النووي الريبي المطلوب ثم بالتقليدية بكر أو qPCR من عينة من هذا القبيل. هذا التنوع هو الميزة الرئيسية لنهج RT-PCR الخطوة 2؛ وهو يوفر حمام سباحة طويلة الأجل التي يمكن استخدامها للعديد من التجارب المختلفة. كانت تمثل نهجاً RT-PCR خطوة واحدة في النتائج، حيث كانت تستخدم تسلسل معين الإشعال (الجدول 1) و RT وبكر أجريت في أنبوب واحد (انظر قائمة المواد). وبصفة عامة، تسلسل الإشعال محددة تسمح بكفاءة RT أعلى من الهدف محدد الحمض النووي الريبي من استخدام فتيلة عشوائية، ولكن الهدف محدد الحمض النووي الريبي هي الوحيدة التي يمكن قياسها كمياً في عينة كدنا هذه التي قد يكون الهدف الوحيد من مختبرات معينة (انظر جدول المواد لكدنا توليف الاقتراحات المنتج).
في حين يبدو RT-PCR التقليدي الشائع استخدامها حتى الآن في تيلف تشخيص9،13،14،15،16،،من1718، 33 , 35 , 48 , 55-RT-qPCR قد ثبت أن تكون أداة أكثر قوة للكشف والتحديد الكمي لكميات صغيرة من تيلف في أنسجة الأسماك أو مخاط32،37. وبوجه عام، يستخدم على نطاق واسع في مختبرات التشخيص السريري في علم الفيروسات نظراً لحساسية عالية، وخصائصه، وإمكانية تكرار نتائج جيدة، ودينامية واسعة النطاق والسرعة21qPCR. بينما qPCR قد يكون أكثر تكلفة في البداية تنفيذا من التقليدية الرايت-بكر، تقدم العديد من المزايا الهامة عبر PCR التقليدية؛ فقد أسرع تحول وقتاً من عينة للنتائج وأنها لا تتطلب أي خطوات بوست-PCR. هذه النقطة الأخيرة تعني أن هناك الحد الأدنى من المخاطر لتلوث المختبرات، ويمكن تكييفها بسهولة أكبر لحالات الفائق كما هو الحال في حالة تفشي. وعلاوة على ذلك، فمن طبيعتها أكثر حساسية من التقليدية الرايت-بكر، الذي يتسم بأهمية حيوية للكشف عن انخفاض الأحمال الفيروسية في الإصابات السريرية الفرعية21. وهذا يتطلب اتباع نهج بكر متداخلة تتطلب النسخ العكسي، اثنين كذلك بكر ردود الفعل ومن ثم تحليل من [اغروس] هلام التفريد. العديد من الخطوات يستغرق الكثير من الوقت وتزيد من فرص الأخطاء أو التلوث. ومع ذلك، نظراً لحساسية عالية، يطالب RT-qPCR التصميم التجريبي الدقيق، وفهم دقيق لتقنيات القياس الكمي لتوليد نتائج دقيقة56،57.
فلوروفوري ربط الحمض النووي، “سيبر الأخضر” قد أثبت في هذا البروتوكول. وصبغة ربط الحمض النووي غير محدد دسدنا وهكذا تكمن خصوصية المقايسة كلياً في مجموعة الإشعال، مما قد يولد المغلوطة58. ولذلك، بينما دسدنا ذوبان تحليل منحنى في نهاية كل بكر جزء مهم خاصة لتفاعل PCR لأنه يؤكد أن amplicon PCR واحد فقط من تي الصحيح يتم إنتاجم (ويجب أيضا أن يتحقق بهلام التفريد عندما يجري فحوصات جديدة). تيم من جزء من الحمض النووي يعتمد على مجموعة متنوعة من الميزات مثل الطول، تكوين GC، تسلسل، التكامل حبلا، وتركيز فضلا عن المخزن المؤقت المكونات ومحسنات PCR. التحليلات منحنى ذوبان في نتائج تمثيلية سيظهر اثنان من المختبرات لم تكشف عن الوجود-مبلمر أو منتجات PCR الأخرى غير المرغوب فيها ولكن إذا كان هذا هو لاحظ مع عينات أخرى و/أو الهياكل التجريبية، ثم ينبغي أن يكون الفحص إعادة الأمثل. QPCR تكنولوجيات أكثر تقدما لا تتطلب مثل هذه خطوة منحنى ذوبان وفي الواقع، منذ هذه الأساليب كتب الورقة، تكمان أساس تيلف RT-qPCR وضعت استخدام كبسولة تفجير اثنين وتحقيق يجعلها شديدة محددة تيلف34.
مما لا شك فيه، كبسولة تفجير مصممة لفحوصات RT qPCR تعتبر أساسية لنجاح الفحص والإشعال هنا صممت استناداً إلى البيانات الجينومية تيلف متاحة للجمهور في الساعة32. ومع ذلك، فيروسات الرنا معروفة ليحمل طفرة ارتفاع أسعار وسلالات ممكن سوف الهروب الاختبارات التشخيصية الحالية، كما لوحظ إيساف59. دائماً سيكون من الصعب لمثل هذه الأنواع من الفيروسات لتوليد الرايت تيلف عموم عالمي-الإنزيم قبكر وهذه الاختبارات سيتم فقط باستمرار تحسين إذا توفرت بيانات الجينوم تيلف أكثر من مواقع بعيدة المدى والفترات الزمنية.
وأخيراً، من الضروري لتشغيل مكررة أو ثلاث إذا كان ذلك ممكناً، ردود فعل في داخلها على حد سواء وجملة فحوصات qPCR. إذا كانت قيمt ج عالية جداً، ثم استخدام replicates مهم بشكل خاص للتأكد من أن رد فعل PCR موثوق بها واستنساخه. بشكل عام، إذا كان تكرار البيانات من ردود الفعل تتفاوت الدورات أكثر من 0.5، ردود الفعل ينبغي أن يتكرر ويعيد إذا تختلف قيمt C استمرار دورات > 0.5 في، التحليل، ينبغي أن يكون الأمثل إعادة. ويساعد استخدام روبوت بيبيتينج qPCR المتكاملة هائلة مع هذه المسألة، ولكن أداة الرفاهية. مع أي تجربة، وضوابط كافية ومناسبة إدراج أهمية قصوى لتطوير فحوصات الجزيئية قوية، لا سيما في مختبرات التشخيص فيها مثل هذه الاختبارات يجب أن تكون معتمدة. ينبغي أن تتضمن عناصر إيجابية (الإيجابية تيلف عينة، تيلف بلازميد القياسية) وعناصر سلبية العينات (المجلس الوطني الانتقالي و-RT)، فضلا عن الكشف عن الجينات التدبير المنزلي البلطي الذاتية. هذه الضوابط لا يمكن الاستهانة به، وينبغي أن تدرج في كل تحليل بشكل صحيح فهم نوعية كل خطوة التحليل وتفسير النتائج بشكل صحيح.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لمعهد علم الجراثيم البيطرية، كلية فيتسويسي، وجامعة بيرن لدعمهم. تم تمويل هذا العمل من اللجنة “تعزيز الأكاديمية للباحثين الوظيفي المبكر” والمساواة بين الجنسين في كلية فيتسويسي، جامعة برن من 120% نموذج التمويل الممنوح للسندات الإذنية. WS والعلاقات العامة معتمدة من قبل مركز الدراسات المتقدمة للزراعة والأغذية، ومعهد الدراسات المتقدمة، جامعة كاسيتسارت، بانكوك، تايلند، في إطار تعزيز بحوث التعليم العالي والوطنية أبحاث جامعة المشروع في تايلند، مكتب تايلند اللجنة، وزارة التعليم والتعليم العالي. ونود أن نشكر الدكتور سيريكانتشانا كونروي لبلدها السرد وسكارين بيياواتشارا لتحرير الفيديو.
Materials
| Tissue collection | Step 1 | ||
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative to clove oil. Step 1.1 |
| RNAlater stabilization solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | For storing tissues if they cannot be processed immediately Step 1.3 |
| RNA extraction | Step 2 | ||
| TRIreagent | Sigma-Aldrich | Step 2.1 | |
| TRIzol | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 15596026 | Step 2.1 |
| GENEzol | Geneaid | GZR100 | Step 2.1 |
| Trisure | Bioline | BIO-38032 | Step 2.1 |
| Homemade solution | - | - | 94.53 g/L (800 mM) guanidine thiocyanate 30.45 g/L (400 mM) ammonium thiocyanate 8.20 g/L (100 mM) sodium acetate 380 mL/L (38 % v/v) phenol 50 mL/L (5 % v/v) glycerol 1.0 g/L (0.1 % w/v) 8-quinolinol, pH 5.0 Store up to 2 years at 4oC Step 2.1 |
| MagNA Lyser Green Beads | Roche | 3358941001 | An alternative tissue homogenization method used in conjunction with tissue lysing machines detailed below Step 2.2 |
| Lysing Matrix D, 2 mL Tube | MP BIOMEDICALS | 116913050 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | Step 2.3 |
| Chloroform | RCI Labscan | AR1027E-G2.5L | Step 2.3 |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B9673 | A less toxic alternative to chloroform Step 2.3 |
| Isopropanol (GC) ≥ 99.8 % | Sigma-Aldrich | 59300 | Step 2.6 |
| Isopropanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.09634.2500 | Step 2.6 |
| Glycogen, molecular biology grade (e.g., Sigma, cat. no. G1767) | Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific) | R0551 | Useful step if tissue starting material is small to maximise RNA precipitation optional |
| Ethanol (purity (GC) ≥ 99.9 % | Sigma-Aldrich (EMD Millipore) | 1.00983 | Step 2.9 |
| Ethanol (ACS, ISO Reag. Ph Eur) | Merck (EMSURE) | 1.00983.2500 | Step 2.9 |
| Nuclease-free water | Promega | P1193 | Step 2.13 |
| Nuclease-free water | Multicell | 809-115-CL | Step 2.13 |
| Ambion TURBO DNA-free kit | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | AM1907 | Can be performed at the end of the RNA extraction protocol optional |
| cDNA synthesis | Step 4 | ||
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis | cDSK01 | Step 4.1 & 4.3 |
| ReverTra Ace qPCR RT MasterMix with gDNA remover | Toyobo | A1172K | An alternative option see discussion |
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | An alternative option see discussion |
| AffinityScript Multiple Temperature Reverse Transcriptase | Agilent Technologies | 600107 | An alternative option |
| PCR | Step 5 | ||
| DNA polymerase systems: | Step 5.2 | ||
| – Platinum II Hot-Start Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Fisher Scientific (Invitrogen) | 14001012a | Step 5.2 |
| – GoTaq Mastermix | Promega | M7122 | Step 5.2 |
| Separate PCR mixture components: | Step 5.2 | ||
| 10mM dNTP Mix | Vivantis | NP2409 | Step 5.2 |
| 25mM MgCl2 | Thermo Fisher Scientific | R0971 | Step 5.2 |
| 10X Taq Buffer with KCl | Thermo Fisher Scientific | 00348114 | Step 5.2 |
| Taq DNA polymerase | Vivantis | PL1202 | Step 5.2 |
| – Verso 1-step RT-PCR ReddyMix with ThermoPrime Taq | Thermo Fisher Scientific | AB1454 | One step RT-PCR exemplified in Figure 3B |
| Gel electrophoresis: | For visulation of PCR products from steps 5.1-5.4 | ||
| Ethidium Bromide solution (10 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 17898 | Step 5.5 |
| Tris/Acetic/EDTA (TAE) buffer: | Step 5.5 | ||
| – Tris | Vivantis | PR0612-1KG | Step 5.5 |
| – Acetic acid (glacial) (ACS, ISO, Reag. Ph Eur) | Merck KGaA (EMSURE) | 1.00063.2500 | Step 5.5 |
| – Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | BIO-RAD | 161-0729 | Step 5.5 |
| Agarose | Vivantis | PC0701-100G | Step 5.5 |
| DNA ladders and markers | Vivantis | NL1405 | Step 5.5 |
| DNA gel loading dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Step 5.5 |
| qPCR | Step 6 | ||
| PowerUP SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | A25779 | Exemplified in Figures4-6B Step 6.2 |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725120 | Exemplified in the video and in Figures 4-6A Step 6.2 |
| Equipment | |||
| Dounce tissue grinder pestle | Sigma-Aldrich | P1110 | Protocol 2 |
| MagNA Lyser Instrument | Roche | 3358976001 | An alternative tissue homogenizing option for protocol 2 which are used in conjunction with the lysing beads detailed above Step 2.2 |
| FastPrep-24 5G Homogenizer | MP BIOMEDICALS | 116005500 | |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5427R | Protocol 2 Step 2.4, 2.7 & 2.10 |
| Refrigerated microcentrifuge | Eppendorf | Eppendorf 5418R | |
| Heat box | Labnet | AccuBlock Digital Dry Bath | Protocol 2 Step 2.13 |
| Microvolume spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific (Applied Biosystems) | Nanodrop 2000 | Protocol 3 Step 3.1 – 3.4 |
| PCR machine | BIO-RAD | T100 Thermal Cycler | Protocol 5 Step 5.4 |
| Power supply | BIO-RAD | PowerPac HC | Protocol 5 Step 5.5 |
| Horizontal gel electrophoresis | BIO-RAD | Mini ReadySub-Cell GT Cell #1704487edu | Protocol 5 Step 5.5 |
| Mini microcentrifuge | Corning | LSE 6766 | Useful to quickly spin down PCR reaction tubes in protocols 4, 5 & 6 Step 6.5.1 |
| Microcentrifuge | LioFuge | LM-60 | Step 6.5.1 |
| qPCR machine and software | Thermo Fisher Scientific | 7500 Fast Real-Time PCR System with 7500 Software v2.0 | Protocol 6 Step 6.6-6.8 |
| qPCR machine and software | BIO-RAD | CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System with CFX Manager software | |
| General Materials | |||
| Mayo scissors | Step 1.1-1.2 | ||
| Forceps | Step 1.1-1.2 | ||
| Pipette | Rainin | Pipette-Lite XLS | |
| Aerosol-barrier pipette tips | Sigma-Aldrich | Z333328, Z333336, Z333344 | |
| Nuclease-free 1.5-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf |
References
- FAO. . The State of World Fisheries and Aquaculture, 2014. Opportunities and Challenges. , (2014).
- FAO. . The State of World Fisheries and Aquaculture, 2016. Contributing to Food Security and Nutrition for all. , (2016).
- WorldBank. . FISH TO 2030: Prospects for Fisheries and Aquaculture. Agriculture and Environmental Services Discussion Paper 03. , (2013).
- Wing-Keong, N., Nicholas, R. A review of the nutrition and feeding management of farmed tilapia throughout the culture cycle. Reviews in Aquaculture. 5 (4), 220-254 (2013).
- Cleasby, N., et al. The socio-economic context for improving food security through land based aquaculture in Solomon Islands: A peri-urban case study. Marine Policy. 45, 89-97 (2014).
- Ponzoni Raul, W., et al. Genetic improvement of Nile tilapia (Oreochromis niloticus) with special reference to the work conducted by the WorldFish Center with the GIFT strain. Reviews in Aquaculture. 3 (1), 27-41 (2011).
- Hounmanou, Y. M. G., et al. Tilapia lake virus threatens tilapiines farming and food security: Socio-economic challenges and preventive measures in Sub-Saharan Africa. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 493, 123-129 (2018).
- OIE. . Tilapia Lake Virus (TiLV) – a novel orthomyxo-like virus. OIE technical disease cards. , (2018).
- Mugimba, K. K., et al. Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria. Journal of Fish Diseases. , (2018).
- Koesharyani, I., Gardenia, L., Widowati, Z., Khumaira, D. D., Rustianti, Studi kasus infeksi tilapia lake virus (tilv) pada ikan nila (Oreochromis niloticus). Jurnal Riset Akuakultur. 13 (1), 85-92 (2018).
- OIE. . Tilapia lake virus disease (TiLV), Chinese Taipei. Immediate Notification. , (2017).
- OIE. . Tilapia Lake Virus Disease (TiLV), Peru. Immediate Notification. , (2018).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), e00431-e00416 (2016).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Nicholson, P., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Egyptian fish farms experiencing high mortalities in 2015. Journal of Fish Diseases. 40 (12), 1925-1928 (2017).
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Tattiyapong, P., Dachavichitlead, W., Surachetpong, W. Experimental infection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) and red tilapia (Oreochromis spp.). Veterinary Microbiology. 207, 170-177 (2017).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Thangaraj, R. S., et al. Derivation of two tilapia (Oreochromis niloticus) cell lines for efficient propagation of Tilapia Lake Virus (TiLV). Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 492, 206-214 (2018).
- Hanson, L. A., Rudis, M. R., Vasquez-Lee, M., Montgomery, R. D. A broadly applicable method to characterize large DNA viruses and adenoviruses based on the DNA polymerase gene. Virology Journal. 3, 28-28 (2006).
- Josko, D. Molecular virology in the clinical laboratory. Clinical Laboratory Science. 23 (4), 231-236 (2010).
- Munir, K., Kibenge, F. S. Detection of infectious salmon anaemia virus by real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 117 (1), 37-47 (2004).
- Snow, M., et al. Developement, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo salar). Developments in Biologicals. 126, 133-145 (2006).
- Matejusova, I., McKay, P., McBeath, A. J., Collet, B., Snow, M. Development of a sensitive and controlled real-time RT-PCR assay for viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) in marine salmonid aquaculture. Diseases of Aquatic Organisms. 80 (2), 137-144 (2008).
- Garver, K. A., et al. Development and validation of a reverse transcription quantitative PCR for universal detection of viral hemorrhagic septicemia virus. Diseases of Aquatic Organisms. 95 (2), 97-112 (2011).
- Dalla Valle, L., et al. Development of a sensitive and quantitative diagnostic assay for fish nervous necrosis virus based on two-target real-time PCR. Veterinary Microbiology. 110 (3-4), 167-179 (2005).
- Hodneland, K., Garcia, R., Balbuena, J. A., Zarza, C., Fouz, B. Real-time RT-PCR detection of betanodavirus in naturally and experimentally infected fish from Spain. Journal of Fish Diseases. 34 (3), 189-202 (2011).
- Hodneland, K., Endresen, C. Sensitive and specific detection of Salmonid alphavirus using real-time PCR (TaqMan). Journal of Virological Methods. 131 (2), 184-192 (2006).
- Wang, X. W., Ao, J. Q., Li, Q. G., Chen, X. H. Quantitative detection of a marine fish iridovirus isolated from large yellow croaker, Pseudosciaena crocea, using a molecular beacon. Journal of Virological Methods. 133 (1), 76-81 (2006).
- van Beurden, S. J., et al. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of anguillid herpesvirus 1. Journal of Fish Diseases. 39 (1), 95-104 (2016).
- Ciulli, S., et al. Development and application of a real-time PCR assay for the detection and quantitation of lymphocystis disease virus. Journal of Virological Methods. 213, 164-173 (2015).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 476, 111-118 (2017).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 497, 184-188 (2018).
- Behera, B. K., et al. Emergence of Tilapia Lake Virus associated with mortalities of farmed Nile Tilapia Oreochromis niloticus (Linnaeus 1758) in India. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 484, 168-174 (2018).
- Ferguson, H. W., et al. Syncytial hepatitis of farmed tilapia, Oreochromis niloticus (L.): a case report. Journal of Fish Diseases. 37 (6), 583-589 (2014).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 486, 75-80 (2018).
- Yang, C. G., et al. Evaluation of reference genes for quantitative real-time RT-PCR analysis of gene expression in Nile tilapia (Oreochromis niloticus). Gene. 527 (1), 183-192 (2013).
- Bustin, S. A. Real-time, fluorescence-based quantitative PCR: a snapshot of current procedures and preferences. Expert Review of Molecular Diagnostics. 5 (4), 493-498 (2005).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 126-139 (2006).
- Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 27 (2-3), 95-125 (2006).
- Mackay, I. M., Arden, K. E., Nitsche, A. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Research. 30 (6), 1292-1305 (2002).
- Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
- Bustin, S. A. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology. 25 (2), 169-193 (2000).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Research. 6 (10), 986-994 (1996).
- Rutledge, R. G., Côté, C. Mathematics of quantitative kinetic PCR and the application of standard curves. Nucleic Acids Research. 31 (16), e93-e93 (2003).
- Svec, D., Tichopad, A., Novosadova, V., Pfaffl, M. W., Kubista, M. How good is a PCR efficiency estimate: Recommendations for precise and robust qPCR efficiency assessments. Biomolecular Detection and Quantification. 3, 9-16 (2015).
- Amal, M. N. A., et al. A case of natural co-infection of Tilapia Lake Virus and Aeromonas veronii in a Malaysian red hybrid tilapia (Oreochromis niloticus × O. mossambicus) farm experiencing high mortality. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 485, 12-16 (2018).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by ‘summer mortality’ syndrome. Aquaculture (Amsterdam, Netherlands). 473, 430-432 (2017).
- OIE. . Tilapia Lake Virus disease (TiLV), Philippines. Immediate Notification. , (2017).
- OIE. . Tilapia lake virus disease (TiLV), Malaysia. Immediate Notification. , (2017).
- Abdullah, A., et al. First detection of tilapia lake virus (TiLV) in wild river carp (Barbonymus schwanenfeldii) at Timah Tasoh Lake, Malaysia. Journal of Fish Diseases. 41 (9), 1459-1462 (2018).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1 (2), 581-585 (2006).
- Del-Pozo, J., et al. Syncytial Hepatitis of Tilapia ( Oreochromis niloticus L.) is Associated With Orthomyxovirus-Like Virions in Hepatocytes. Veterinary Pathology. 54 (1), 164-170 (2017).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Purcell, M. K., Getchell, R. G., McClure, C. A., Garver, K. A. Quantitative polymerase chain reaction (PCR) for detection of aquatic animal pathogens in a diagnostic laboratory setting. Journal of Aquatic Animal Health. 23 (3), 148-161 (2011).
- Simpson, D. A., Feeney, S., Boyle, C., Stitt, A. W. Retinal VEGF mRNA measured by SYBR green I fluorescence: A versatile approach to quantitative PCR. Molecular Vision. 6, 178-183 (2000).
- Kibenge, M. J., et al. Discovery of variant infectious salmon anaemia virus (ISAV) of European genotype in British Columbia, Canada. Virology Journal. 13, 3 (2016).
