Summary

血管新生に対する天然物の影響を評価するHUVECチューブ形成アッセイ

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

ここでは、ゲル化基マトリックス上のチューブ形成アッセイを用いて、ルタ・グラボレンズの水抽出物が血管ネットワーク形成に及ぼす影響を評価する。

Abstract

血管新生は、内皮細胞増殖、分化、移動などの異なるプロセスを含む現象であり、新しい血管の形成につながり、いくつかのシグナル伝達経路を伴う。ここでは、管形成アッセイが血管新生に対する天然物の影響を評価し、関連する分子機構を調べるための単純なインビトロ法であることを示す。特に、ルタ・グラボレン(RGWE)の水抽出物の存在下では、内皮細胞は細胞ネットワークを形成することができなくなり、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)管形成に対するRGWE効果が廃止される。MEKの構成的活性化。

Introduction

血管新生は、既存のものから新しい血管の形成につながり、胚形成および臓器の成長中に起こる生理学的プロセスである。成人期には、血管新生は、サイクリング卵巣、妊娠中の胎盤、および創傷治癒および修復中にのみ活性化される。血管新生は、内皮細胞が増殖し、分化し、無傷の血管ネットワーク1を形成するために移行する能力に依存する。しかし、炎症性、代謝性疾患、リウマチ性疾患などのいくつかの疾患では、血管新生プロセスが変化し、血管新生が過剰になる。さらに、制御されていない血管新生プロセスはまた、腫瘍の進行および転移1を刺激する。これらの理由から、過去10年間の研究研究は、癌、眼、関節、または皮膚疾患2、3における過剰な血管新生の阻害を目的とした新しい治療戦略の開発に焦点を当てている。

血管内皮増殖因子(VEGF)は、現在の抗血管新生療法4の主な標的を表し、およびいくつかの抗VEGFモノクローナル抗体が開発され、過剰な血管新生を防ぐために合成されている。しかし、これらの合成薬物は重篤な副作用を示し、不利な費用対利益比5、6を有する。したがって、現在使用されている薬剤を補完し、組み合わせるために最小限の副作用で過剰な血管新生を制限する新しい治療戦略を見つけることが不可欠です。これらの新薬は、高い化学的多様性と生化学的特異性を特徴とする天然物の中で見つけることができます。

本論文では,RGWEがインビトロ5のゲル化基マトリックス上で管状を形成する能力に対するRGWEの影響を評価する簡単な方法を提案する.実際、RGWEは、ルチンが主要成分5であるフラボノイドおよびポリフェノールなどの二次代謝産物の混合物である。それらの多くは、すでに抗炎症および血管保護剤7、8、9、10、11としてテストされています。さらに、最近では、ルチンではなくRGWEがゲル化基基マトリックス上で管状を形成するHUVEC能力を阻害し、この現象がMEK-ERK経路によって媒介され、RGWEが潜在的な治療ツールとしてできることを示している。過度の新しい血管形成を防ぐ 5.

Protocol

1. RGWE準備 植物学者の監督の下、春/夏の間に植物からR.グラボレンズの葉を収集します。注:この場合、葉はナポリの植物園の薬用植物の実験セクションで収集されました, イタリア5.植物は自発的で多年生であり、地中海地域に存在する(図1)。 250gの葉の重量を量り、細かくはさみでそれらを刻みます。 葉を…

Representative Results

血管新生に対するRGWEの影響を評価するために、ゲル化基基マトリックス上のチューブ形成アッセイを行った。その上で培養すると、HUVECは細長く見える細胞に由来し、互いに接続して細胞ネットワークを形成するチューブ状の構造を形成する(図2)。図3では、RGWEで処理したHUVECの分岐数が、制御条件と比較して有意に少なく…

Discussion

天然化合物は、高い化学的多様性と生化学的特異性によって特徴付けられており、潜在的に治療的分子の供給源を表します。ここでは、植物R.graveolensから水抽出物を得る方法を示し、血管新生に対するRGWEの効果を調べるために有用な、実行しやすい、信頼性が高く、定量的な方法としてチューブ形成アッセイを提案する。完全な水抽出物を得るためには、R.グラボレンズの葉を1…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、フォンディ・ディ・アテネオからルカ・コルッチ・ダマト、ヴァレ・プログラムの資金をマリア・テレサ・ジェンタイルとAIRCファンドIG18999からマウリツィオ・ビフルコに資金提供しました。

Materials

HUVEC cells Clontech C2519A
FBS Invitrogen 10270106
EBM-2 basal medium Clontech cc3156
Single quot kit- supplemets and growth factors clontech cc4147
Matrigel Corning 354234
96-well plates Thermo Scientific 167008
15 mL conical tubes Sarstedt 62,554,502
10 mL disposable serological pipette Sarstedt 861,254,001
5 mL disposable serological pipette Sarstedt 861,253,001
1000 μL pipette Gilson Pipetman classic
100 μL pipette Gilson Pipetman classic
20 μL pipette Gilson Pipetman classic
p1000 pipette tips Sarstedt
p20-200 pipette tips Sarstedt 70,760,502
Burker chamber Fortuna
Trypan blu stain Gibco 15250-061
DPBS Gibco 14190-094
mill-ex 0.22 um filters Millipore SLGS033SS
Lyophilizer VirTis-SP Scientific
Incubator Thermo Scientific
CO2 AirCos
Pen-Strep Gibco 15070-063
100 mm dish Sarstedt 833,902
pcDNA3 Invitrogen v79020
Lipofectamine-2000 Invitrogen 11668027
Opti-MEM Gibco 31985070 Reduced serum medium
Rutin Sigma-Aldrich R5143-50G
Axiovert 25 microscope Zeiss
AmScope MD500 camera AmScope
Dispase Thermo Scientific D4818
Lab heater Falc
ParaFilm American National Can

References

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Cite This Article
Gentile, M. T., Pastorino, O., Bifulco, M., Colucci-D’Amato, L. HUVEC Tube-formation Assay to Evaluate the Impact of Natural Products on Angiogenesis. J. Vis. Exp. (148), e58591, doi:10.3791/58591 (2019).

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