HuVEC Analisi della formazione di tubi per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi
Summary
Qui, valutiamo gli effetti dell’estratto d’acqua dei tombolens di Ruta sulla formazione della rete navale utilizzando un saggio di formazione del tubo su una matrice sotterranea gelata.
Abstract
L’angiogenesi è un fenomeno che comprende diversi processi, come la proliferazione delle cellule endoteliali, la differenziazione e la migrazione, che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni e coinvolgono diversi percorsi di trasduzione del segnale. Qui dimostriamo che il test di formazione dei tubi è un semplice metodo in vitro per valutare l’impatto dei prodotti naturali sull’angiogenesi e per studiare i meccanismi molecolari coinvolti. In particolare, in presenza dell’estratto d’acqua di Ruta graveolens (RGWE), le cellule endoteliali non sono più in grado di formare una rete cellulare e che gli effetti di RGWE sulla formazione di tubi endoteliali delle cellule ombelicali umane (HUVEC) sono aboliti attivazione coniugale di MEK.
Introduction
L’angiogenesi è un processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni da quelli preesistenti e si verifica durante l’embriogenesi e la crescita degli organi. In età adulta, l’angiogenesi si attiva solo nell’ovaia ciclistica, nella placenta durante la gravidanza e durante la guarigione e la riparazione della ferita. L’angiogenesi dipende dalla capacità delle cellule endoteliali di proliferare, differenziare e migrare per formare una rete vascolare intatta1. Tuttavia, in diversi disturbi, come le malattie infiammatorie, metaboliche e reumatiche, i processi angiogenici sono alterati e l’angiogenesi diventa eccessiva. Inoltre, i processi angiogenici incontrollati stimolano anche la progressione del tumore e la metastasi1. Per questi motivi, nell’ultimo decennio, gli studi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche volte all’inibizione dell’eccessiva angiogenesi nei disturbi del cancro, oculare, articolare o della pelle2,3.
Il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) rappresenta l’obiettivo principale delle attuali terapie antiangiogeniche4e sono stati sviluppati e sintetizzati diversi anticorpi monoclonali anti-VEGF per prevenire l’eccessiva angiogenesi. Tuttavia, queste droghe sintetiche mostrano gravi effetti collaterali e hanno un rapporto costo-beneficio sfavorevole5,6. Pertanto, è imperativo trovare nuove strategie terapeutiche per limitare l’angiogenesi eccessiva con effetti collaterali minimi per integrare e combinare con farmaci attualmente utilizzati. Questi nuovi farmaci possono essere trovati tra i prodotti naturali che sono caratterizzati da un’elevata diversità chimica e specificità biochimica.
In questo articolo, proponiamo un metodo semplice per valutare l’impatto del RGWE sulla capacità degli HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata in vitro5. Infatti, RGWE è una miscela di metaboliti secondari come flavonoidi e polifenoli tra i quali la rutina è il componente principale5. Molti di loro sono già stati testati come agenti anti-infiammatori e vasoprotettivi7,8,9,10,11. Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che RGWE, ma non la rutina, è in grado di inibire la capacità HUVEC di formare tubuli su una matrice sotterranea gelata e che questo fenomeno è mediato dal percorso MEK-ERK, indicando RGWE come un potenziale strumento terapeutico in grado di prevenire l’eccessiva formazione di nuovi vasi sanguigni5.
Protocol
Representative Results
Discussion
I composti naturali sono caratterizzati da un’elevata diversità chimica e specificità biochimica e rappresentano una fonte di molecole potenzialmente terapeutiche. Qui, mostriamo come ottenere l’estratto d’acqua dalla pianta R. graveolens e proponiamo il saggio di formazione dei tubi come un metodo facile da eseguire, affidabile e quantitativo utile per studiare gli effetti di RGWE sull’angiogenesi. È importante far bollire le foglie di R. graveolens per 1 h per essere sicuri di ottenere l’estratto d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da Fondi di Ateneo ai fondi di Luca Colucci-D’Amato e ValeRE Program a Maria Teresa Gentile e al fondo AIRC IG18999 a Maurizio Bifulco.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
- Carmeliet, P. Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).
- Carmeliet, P., Jain, R. K. Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis. Nature. 473 (7347), 298-307 (2011).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Ravishankar, D., Rajora, A. K., Greco, F., Osborn, H. M. I. Flavonoids as prospective compounds for anti-cancer therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45, 2821-2831 (2013).
- Gentile, M. T., et al. Ruta graveolens water extract inhibits cell-cell network formation in human umbilical endothelial cells via MEK-ERK1/2 pathway. Experimental Cell Research. 364 (1), 50-58 (2018).
- Butler, M. S. Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials. Natural Product Reports. 25, 475-516 (2008).
- Sulaiman, R. S., Basavarajappa, H. D., Corson, T. W. Natural product inhibitors of ocular angiogenesis. Experimental Eye Research. 129, 161-171 (2014).
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Trung, N. X. In vitro models for angiogenesis. Journal of Science & Development. 13 (4), 850-858 (2015).
- Ucuzian, A. A., Greisler, H. P. In vitro Models of Angiogenesis. World Journal of Surgery. 31, 654-663 (2007).
- Simons, M., et al. American Heart Association Council on Basic Cardiovascular Sciences and Council on Cardiovascular Surgery and Anaesthesia. State-of-the-Art Methods for Evaluation of Angiogenesis and Tissue Vascularisation: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 116 (11), e99-e132 (2015).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nature Protocols. 5 (4), 628-635 (2010).
- DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments. (91), e51312 (2014).
