HUVEC Tube-Formation Assay zur Bewertung der Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese
Summary
Hier evaluieren wir die Auswirkungen des Wasserextrakts von Ruta-Grabolen auf die Gefäßnetzbildung, indem wir einen Rohrbildungstest auf eine gegelte Kellermatrix verwenden.
Abstract
Angiogenese ist ein Phänomen, das verschiedene Prozesse umfasst, wie endotheliale Zellproliferation, Differenzierung und Migration, die zur Bildung neuer Blutgefäße führen und mehrere Signaltransduktionswege beinhalten. Hier zeigen wir, dass der Rohrbildungstest eine einfache In-vitro-Methode ist, um die Auswirkungen natürlicher Produkte auf die Angiogenese zu bewerten und die beteiligten molekularen Mechanismen zu untersuchen. Insbesondere sind Endothelzellen in Gegenwart des Wasserextrakts von Ruta graveolens (RGWE) nicht mehr in der Lage, ein Zellzellnetz zu bilden, und dass die RGWE-Wirkungen auf die Endothelzellbildung der menschlichen Nabelvene (HUVEC) durch die konstitutive Aktivierung von MEK.
Introduction
Angiogenese ist ein physiologischer Prozess, der zur Bildung neuer Blutgefäße aus bereits bestehenden führt und während der Embryogenese und des Organwachstums auftritt. Im Erwachsenenalter wird die Angiogenese nur im Radfahren des Eierstocks, in der Plazenta während der Schwangerschaft und während der Wundheilung und -reparatur aktiviert. Die Angiogenese hängt von der Fähigkeit der Endothelzellen ab, sich zu vermehren, zu differenzieren und zu einem intakten Gefäßnetz zu migrieren1. Bei mehreren Erkrankungen, wie entzündlichen, metabolischen und rheumatischen Erkrankungen, werden angiogene Prozesse jedoch verändert und die Angiogenese wird exzessiv. Darüber hinaus stimulieren unkontrollierte angiogene Prozesse auch die Tumorprogression und Metastasierung1. Aus diesen Gründen konzentrieren sich die Forschungsstudien in den letzten zehn Jahren auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Hemmung übermäßiger Angiogenese bei Krebs-, Augen-, Gelenk- oder Hauterkrankungen2,3.
Der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) stellt das Hauptziel der aktuellen antiangiogenen Therapien4dar, und mehrere monoklonale Antikörper gegen VEGF wurden entwickelt und synthetisiert, um eine übermäßige Angiogenese zu verhindern. Jedoch, Diese synthetischen Drogen zeigen schwere Nebenwirkungen und haben ein ungünstiges Kosten-Nutzen-Verhältnis5,6. Daher ist es unerlässlich, neue therapeutische Strategien zu finden, um übermäßige Angiogenese mit minimalen Nebenwirkungen zu begrenzen, um mit derzeit verwendeten Medikamenten zu ergänzen und zu kombinieren. Diese neuen Medikamente finden sich unter natürlichen Produkten, die sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität auszeichnen.
In diesem Artikel schlagen wir eine einfache Methode vor, um die Auswirkungen der RGWE auf die Fähigkeit von HUVECs zu bewerten, Tubuli auf einer gegelten Kellermatrix in vitro5zu bilden. In der Tat ist RGWE eine Mischung aus sekundären Metaboliten wie Flavonoiden und Polyphenolen, unter denen Rutin die Hauptkomponente ist5. Viele von ihnen wurden bereits als entzündungshemmende und vasoprotektive Mittel7,8,9,10,11getestet. Darüber hinaus haben wir vor kurzem gezeigt, dass RGWE, aber nicht Rutin, in der Lage ist, die HUVEC-Fähigkeit, Tubulen auf einer gegelten Kellermatrix zu bilden, zu hemmen und dass dieses Phänomen durch den MEK-ERK-Weg vermittelt wird, was darauf hindeutet, dass RGWE ein mögliches therapeutisches Werkzeug ist, das in der Lage ist, übermäßige Bildung neuer Blutgefäße zu verhindern5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Natürliche Verbindungen zeichnen sich durch eine hohe chemische Vielfalt und biochemische Spezifität aus und stellen eine Quelle potenziell therapeutischer Moleküle dar. Hier zeigen wir, wie man Wasserextrakt aus der Pflanze R. graveolens erhält und schlagen den Rohrbildungstest als einfach durchzuführende, zuverlässige und quantitative Methode vor, die nützlich ist, um die Auswirkungen von RGWE auf die Angiogenese zu untersuchen. Es ist wichtig, die R. graveolens Blätter für 1 h zu kochen, um …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Fondi di Ateneo an Luca Colucci-D’Amato und VALERE Programmfonds an Maria Teresa Gentile und AIRC Fonds IG18999 an Maurizio Bifulco finanziert.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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