HuVEC Tube-formation D'essai pour évaluer l'impact des produits naturels sur l'angiogenèse
Summary
Ici, nous évaluons les effets de l’extrait d’eau de Ruta graveolens sur la formation du réseau de navires en utilisant un essai de formation de tube sur une matrice de sous-sol gélifiée.
Abstract
L’angiogenèse est un phénomène qui comprend différents processus, tels que la prolifération des cellules endothéliales, la différenciation et la migration, qui conduisent à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et impliquent plusieurs voies de transduction du signal. Ici, nous montrons que l’essai de formation de tube est une méthode in vitro simple pour évaluer l’impact des produits naturels sur l’angiogenèse et pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués. En particulier, en présence de l’extrait d’eau de Ruta graveolens (RGWE), les cellules endothéliales ne sont plus en mesure de former un réseau cellulaire et que les effets RGWE sur la formation de tubes de cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) sont abolis par le l’activation constitutive de MEK.
Introduction
L’angiogenèse est un processus physiologique qui conduit à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de ceux préexistants et se produit pendant l’embryogenèse et la croissance des organes. À l’âge adulte, l’angiogenèse n’est activée que dans l’ovaire cycliste, dans le placenta pendant la grossesse, et pendant la cicatrisation et la réparation des plaies. L’angiogenèse dépend de la capacité des cellules endothéliales à proliférer, différencier et migrer pour former un réseau vasculaire intact1. Cependant, dans plusieurs désordres, tels que les maladies inflammatoires, métaboliques, et rhumatismales, les processus angiogéniques sont modifiés et l’angiogenèse devient excessive. En outre, les processus angiogéniques incontrôlés stimulent également la progression de tumeur et la métastasie1. Pour ces raisons, au cours de la dernière décennie, les études de recherche sont axées sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à l’inhibition de l’angiogenèse excessive dans le cancer, oculaire, articulaire, ou les troubles de la peau2,3.
Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) représente lacible principale des thérapies antiangiogenic actuelles 4, et plusieurs anticorps monoclonaux anti-VEGF ont été développés et synthétisés pour empêcher l’angiogenèse excessive. Cependant, ces drogues synthétiques montrent des effets secondaires graves et ont un rapport coût-bénéfice défavorable5,6. Par conséquent, il est impératif de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques pour limiter l’angiogenèse excessive avec des effets secondaires minimes pour compléter et combiner avec les médicaments actuellement utilisés. Ces nouveaux médicaments peuvent être trouvés parmi les produits naturels qui sont caractérisés par une grande diversité chimique et la spécificité biochimique.
Dans cet article, nous proposons une méthode simple pour évaluer l’impact de la RGWE sur la capacité des HUVECs à former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiée in vitro5. En effet, RGWE est un mélange de métabolites secondaires tels que les flavonoïdes et les polyphénols parmi lesquels la rutine est la principale composante5. Beaucoup d’entre eux ont déjà été testés comme agents anti-inflammatoires et vasoprotecteurs7,8,9,10,11. En outre, nous avons récemment démontré que RGWE, mais pas rutin, est capable d’inhiber la capacité HUVEC de former des tubules sur une matrice de sous-sol gélifiéet et que ce phénomène est médié par la voie MEK-ERK, indiquant RGWE comme un outil thérapeutique potentiel capable de prévenir la formation excessive de nouveaux vaisseaux sanguins5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les composés naturels sont caractérisés par une grande diversité chimique et spécificité biochimique et représentent une source de molécules potentiellement thérapeutiques. Ici, nous montrons comment obtenir l’extrait d’eau de la plante R. graveolens et proposons l’essai de formation de tube comme méthode facile à exécuter, fiable, et quantitative utile pour étudier les effets de RGWE sur l’angiogenèse. Il est important de faire bouillir les feuilles de R. graveolens pendant 1 h pour être…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par Fondi di Ateneo à Luca Colucci-D’Amato et les fonds du programme VALERE à Maria Teresa Gentile et le fonds AIRC IG18999 à Maurizio Bifulco.
Materials
| HUVEC cells | Clontech | C2519A | |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | |
| EBM-2 basal medium | Clontech | cc3156 | |
| Single quot kit- supplemets and growth factors | clontech | cc4147 | |
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| 96-well plates | Thermo Scientific | 167008 | |
| 15 mL conical tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| 10 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,254,001 | |
| 5 mL disposable serological pipette | Sarstedt | 861,253,001 | |
| 1000 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 100 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| 20 μL pipette | Gilson | Pipetman classic | |
| p1000 pipette tips | Sarstedt | ||
| p20-200 pipette tips | Sarstedt | 70,760,502 | |
| Burker chamber | Fortuna | ||
| Trypan blu stain | Gibco | 15250-061 | |
| DPBS | Gibco | 14190-094 | |
| mill-ex 0.22 um filters | Millipore | SLGS033SS | |
| Lyophilizer | VirTis-SP Scientific | ||
| Incubator | Thermo Scientific | ||
| CO2 | AirCos | ||
| Pen-Strep | Gibco | 15070-063 | |
| 100 mm dish | Sarstedt | 833,902 | |
| pcDNA3 | Invitrogen | v79020 | |
| Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31985070 | Reduced serum medium |
| Rutin | Sigma-Aldrich | R5143-50G | |
| Axiovert 25 microscope | Zeiss | ||
| AmScope MD500 camera | AmScope | ||
| Dispase | Thermo Scientific | D4818 | |
| Lab heater | Falc | ||
| ParaFilm | American National Can |
References
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