JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Metanol bağımsız ifade tarafından de-baskı teknolojilerinden yararlanan Pichia Pastoris

Published: January 23, 2019
doi:
10.3791/58589
, , , ,
1bisy e.U., 2Institute of Molecular Biotechnology,Technical University of Graz

Summary

Bu yöntem ilk kez karbon düzenlenir Kaynak Rehberleri P istihdam Pichia pastoris (Komagataella phaffii), verimli indüklenebilir metanol-Alerjik Rekombinant protein üretimi için güvenilir deneysel yordamlar açıklanır DCve PDF küçük ölçekli deneylerde ekimi sırasında parametreleri online izlenebilir ve sürekli gliserol besleme uygulanır.

Abstract

Metanol bir iyi kurulmuş karbon kaynağı ve mikro-, laboratuvar ve endüstriyel ölçekte bir ev sahibi gibi Pichia pastoris (P. pastoris) istihdam verimli protein üretimi için uyarıcı olduğunu. Ancak, onun toksisite ve yanma nedeniyle, P. pastorisyüksek verimliliği korunarak metanol önlemek için bir arzusu yoktur. Küçük ölçekli biyoreaktör arazisi (0,5-5 M çalışma birimi) yaygın olarak derin kuyu plakaları microscale ekimi çok az kontrol edilebilir veya pahalı ekipman kullanır beri büyük bir yük ve protein üretim özellikleri değerlendirmek için kullanılır. Kurucu ifade veya metanol indüksiyon ve şimdiye kadar geleneksel iletişim kuralları yetiştirme ve P. pastoris indüksiyon için kurulmuştur Ayrıca, güvenilir iletişim kuralı yok ekran P. pastoris ifade için tarif edildi (kontrollü ve izlenen) paralel arazisi içinde derepressible rehberleri ile suşları. Yem sürekli yavaş gliserol de dahil olmak üzere biyoreaktör koşulları simüle metanol özgür ifade için bir basit sallamak şişesi yetiştirme sistemi kurduk karakterize ve yeni protein üretim suşları karşılaştırmak için ilk böyle arazisi basitleştirmek için ve böylece online izleme çoğunlukla uygulamalı küçük ölçekli toplu arazisi karşılaştırıldığında Biyoreaktörler gerçek koşullarda daha yakın geliyor. Karbon kaynağı P. pastoris, ifadesinde Rekombinant protein sürmeyi PDC ve PDF uygulanmış olan Organizatör bastırılmış. Katıştırılmış karbon kaynağı, gliserol bir ilerleme hızı biyokütle üretimi düşük tutarken Rehberleri etkin korumak için gerekli enerji teslim güvence verdi, sabit bir miktarda serbest ile polimer diskler.

Introduction

Verim ve güvenilir yetiştirme koşulları bakteri ve Maya gibi mikroorganizmalar tarafından Rekombinant protein üretimi için büyük ölçekte iyileşme Binbaşı biridir bugünün biyoteknoloji1 ve Sanayi ticari başarısı ihtiyaçlarını uygulamaları. Karşılaşma basit yetiştirme yordamlar ve medya, yüksek verim ve de karakterize araçları2 Pichia pastoris (Komagataella phaffii) Rekombinant protein üretimi için yaygın olarak kullanılan bir sigara geleneksel Maya. Ek yenilikçi araçlar sürekli yaygın olarak kullanılan PAOX1, organizatörü bölge alkol oksidaz 1 gen3, alternatif olarak yeni rehberleri de dahil olmak üzere yeni ifade vektörel çizimler gibi bu tür için geliştirilen 4,5. 500 bp uzun DNA dizisi akıntıya karşı CAT1 (CTA1) gen P. pastorisyeni metanol-alerjik ve çok yönlü ifade stratejisinde sağlar organizatörü bölge olarak tespit edilmiştir. CAT1 gen P. pastoris tek katalaz gen ve protein peroksizomların içinde yer almaktadır. Katalaz, e.gkaynaklanan reaktif oksijen türleri, detoksifikasyon içinde önemli bir rol oynar., metanol oksidasyon peroksizomal MUT yolu veya yağ asitleri6,7‘ nin beta oksidasyon sırasında üzerinden. CAT1 Gen ifadesinin glikoz veya gliserol ekimi orta prescence bastırılmış ve bu karbon kaynakları8tükenmesi derepressed. Ayrıca, katalaz Gen ifadesinin metanol ve oleik asit, oleik asit bile olarak benzer ifade düzeyleriyle ulaşan ile indüklenen P. pastoris MUT yolun tek gen görünüşte olmak ile de remarkebly ile indüklenen Metanol indüksiyon9.

PDC (bazen de kısaltılmış PCAT1-500) denir, bu P. pastoris CAT1 organizatörü 500 bp parçası önce intracellularly ifade ve salgılanan proteinler üretimi için sınanmış ve olduğu ortaya çıktı bir iki klasik cazip alternatif P. pastoris Rehberleri-güçlü kurucu PGAP ve metanol daha 20 yıl önce geliştirilen indüklenebilir PAOX1,. PDC % 21 (CalB) ve şeker zengin Orta PGAP göre hacimsel faaliyetlerin (HRP) % 35 ulaşmayı başardı. Metanol indüksiyon, üzerine PDC sadece PAOX1daha hızlı yanıt vermedi, ama aynı zamanda açıkça bu bir 2,8 kat daha yüksek son titresi CalB9tarafından topundan daha iyi.

Yanı sıra PDC, bir orthologous organizatörü (PDF) benzer bir düzenleme profil sergileyen tespit edilmedi. Ancak, PDC küçük derepressed yanı sıra daha metanol kaynaklı altında (hazırlık el yazması)3koşullar önemli ölçüde güçlü.

Güçlü kurucu PGAP fizyolojik açıdan sorunlu ya da sitotoksik proteinler10,11nedeniyle başarısız olduğu durumlarda,DC P ve PDF ideal bir alternatif temsil eder. Mikro ölçekli deneyler, bu Organizatör tarafından tahrik ifade başlar ilk karbon kaynak tükenmesi sonra (Örn., glikoz veya gliserol), hangi kolaylaştırır biyokütle üretimi overexpression hücrelerle akneden olmadan Rekombinant protein en başından. Her ikisi de bu Organizatör tarafından metanol hala indüklenebilir olmakla birlikte, belgili tanımlık harekete geçirmek derepression tarafından ek P istihdam ifadeler karşılaştırıldığında preinduction faz kullanırAOX1. Ayrıca, PDC ve PDF büyük endüstriyel proseslerin12için arzu edilen bir hedeftir metanol-Alerjik protein üretimi için kullanılabilir.

Geçerli üretim suşları ve ifade yapıları gelişimi için ölçek-up için tercih edilen aday için transformants çok sayıda daraltmak için geçirilecek geliştirme birkaç adım var. Gösterimleri genellikle çok iyi tabak içinde yüksek işlem hacmi içinde gerçekleştirilir (mikro ölçekli: az 0.5 mL) klonlar mümkün olduğunca büyük bir dizi yakalamak için. Sonraki yeniden tarama ve re-re-screening olduğunu sallamak şişesi tarafından takip sonraki adım (küçük ölçekli: 50-250 mL) veya (mikro-) biyoreaktör gösterimleri12. Ancak, microlitres sallamak şişeler sonraki ölçek-up iyi kontrollü metanol-Alerjik üretim kadar birkaç mililitre kadar derin-şey tabak içinde yüzlerce farklı ölçekler arasında en benzer bir yöntem için katlanmak Biyoreaktörler. Shake şişeler zaten benzer birimler olarak küçük Biyoreaktörler sağlamasına karşın, sürekli besleme, havalandırma ve online izleme13 büyüme gibi büyük ölçekli protein üretim için son derece uygun birçok sınırlamalar vardır ve oksijen kaynağı. Optik izleme istihdam sallamak şişeler uyarlanmış ve sarsma cihazları gibi büyük kültür parametreleri hakkında sürekli online bilgi sağlamaya devam ederken paralel işleme için daha gelişmiş ekipman için düşük maliyetli bir alternatif sağlamak biyokütle ve çözünmüş oksijen konsantrasyonu. Karbon kaynağı yavaş salınımlı polimer gemisi karmaşık teknik çözümler ve cihazlar, Biyoreaktörler daha benzer koşullar daha önce uygulanan basit tam taklit dayanarak olmadan sürekli ve kontrollü besleme güvenliğini sağlamak için uygulanabilir karbon kaynağı9,10, tükenmesi burada devam eden protein ifade için enerji olur sınırlama.

Aşağıdaki yöntemi küçük açıklar orta ölçekli metanol ücretsiz kontrol edilebilir protein ifade için PDC ve PDF. P. pastoris sisteminde yeni Organizatör dayalı İndüksiyon derepression tarafından iki aşamadan oluşur. Protein üretimi olmadan biyokütle birikimi faiz, nerede bir karbon kaynağı küçük ama sabit konsantrasyonlarda sağlanan rehberleri ve hedef protein üretim, ikinci faz represses bir karbon kaynağı’nı ilk kısa aşaması derepressed organizatörü bakımı. Online en kritik ekimi parametreleri izleme tüm yetiştirme döneminde uygulanır. Metanol ücretsiz, güvenilir ve ölçeklenebilir yetiştirme sistemi P. pastorisiçin sağlamak için hedefi oldu.

Protocol

1. medyası hazırlama Arabelleğe alınan en az medya (BMG ile gliserol, dekstroz karbon kaynağı olarak ile BMD) hazırlık (1 L) Otoklav 650 mL distile su 1 L vidalı kapak cam şişede. Aşağı soğutma sonra orta autoclaved 10 x YNB (134 g/L Maya azot temel amino asitler w/o), potasyum fosfat tampon (1 M, pH 6) 200 mL, 30-100 mL % 10 w/v glikoz veya gliserol (bağlı olarak istenilen oluşturulan biyokütle 100 mL ekleyerek tamamlamak toplu işlem sırasında), 2 mL steril 500 x Biotin (10 mg/mL) çözüm ve dolgu 1 L ile steril distile su.Not: Tüm malzemeyi ayrı şişeler içinde autoclaved olmak zorunda. Biotin autoclaved zaman yok ve bu nedenle 0.2 µm membran filtreleri ile sterilize filtre olması gerekiyor. Arabelleğe alınan zengin medya (BYPG) (1 L) Otoklav 700 mL distile su ile % 1 w/v maya özü ve % 2 w/v pepton 1 L vidalı kapak şişede. Aşağı soğutma sonra ayrı ayrı autoclaved % 10 w/v gliserol, potasyum fosfat tampon (1 M, pH 6) 200 mL 30-100 mL ekleyin ve 1 L steril distile su ile doldurun. 2. şişeler hazırlık çalkalanır. 5 mL distile su 250 mL şaşkın eklemek şişeler sallamak, pamuk bez iki kat ile kapak ve lastik bantlar ile yerde düzeltebilirim. Alüminyum folyo bir parça bezle kapak. Otoklav tam sterilizasyon için 20 dk için 121 ° C’de şişeler. Artık su şişesi ve önceden hazırlanmış medya aliquot 50 mL her şişeyi çıkarın. 3. gecede kültür aşı Bir gecede Kültür (Onkoloji) istenen ifade baskı YPD (% 1 w/v maya ekstresi, % 2 w/v pepton, % 2 w/v glikoz) 5 ml 50 mL santrifüj tüpü içinde taze bir koloni kapağı uygun havalandırma izin vermek için biraz açık bırakarak başlayın. Bu gece 28 ° c, % 80 nem, 100-130 rpm (2,5 cm sallayarak çapı) bir shaker büyümek? 4. ölçüm kurulum ve ana kültür ekimi Online izleme sistemi ayarlamak için uygun cihazları kalibrasyonu için üreticinin yönergelerini izleyin. Bir bilgisayarı izlemek için uygun yazılım aralığı ölçüm istasyonları Bluetooth bağlantısı için yüklendiği getirin. Bluetooth aygıtları bağlamak için yazılımını başlatın. Bluetooth bağlantısı biyokütle ölçüm cihazı üzerinde önünde gümüş düğmeye basarak açın. Yazılım, aygıtlar Aygıtları bultıklatın.Not: Cihazlar listesi penceresinde görev sınırının altında olarak görünmesi gerekir. Eğer onlar yapmak değil, bu pillerin dolu ve bilgisayar ulaşmak içinde bir Bluetooth bağlantı için kontrol etmek için tavsiye edilir. Sürükleyin ve Ölçüm tepsisiekranın sağ tarafında bulunan cihazlar kareler için bırakın. Bağlan’ ı tıklatın.Not: ne zaman bağlantı başarılı oldu, kontrol ekranı görüntülenir. Bluetooth bağlantısı için bir deneme başlatmak için ölçümtıklatın. Deneme oluşturmak ayarla. Ölçüm başlatmak, adı deneme’i tıklatın ve izlemek için gereken tüm parametreleri etkinleştirin.Not: Lisans her olası ölçülen parametreler için ihtiyaç vardır. Küme aralığı için 3 dak.Not: Aralığı sıklığını belirler ölçüm noktaları alınır ve her ölçüm noktasında bir değer daha sonra olur. Her dakika ölçme çok doğru olduğunu, ancak büyük miktarda veri hangi geçici o daha zahmetli değerlendirmek oluşturulur. Ortalama ölçüm noktaları 11’e ayarlayın.Not: Bu ayarı kaç ölçüm zamanlarda aslında her 3 dakikada alınan belirler. Bu nedenle, 11 ölçüm puan üzerinde 11 ortalama değeri alınan çıktı s. Örnekleri için adlarını girin. Açı zaten (daha önce adım 4.1) kalibre olarak sonraki ekrana geçin.Not: Ana kültür aşı daha önce Bluetooth bağlantısı için bir deneme istikrarlı bağlantı ve bağlı bilgisayar uygun konumunu sağlamak için tavsiye edilir. Pilleri tahsil de. Yetiştirme ortamı (1:20) seyreltilmiş Onkoloji (adım 3.1) hücre yoğunluğu spektrofotometre 600 nm dalga boyu, ölçü birimi. Orta 50 mL aşılamak (önerilen karbon kaynağı konsantrasyon 0,3-%1, 1. adımda açıklandığı gibi farklı medya mümkün.) aşağıdaki hesaplamayı kullanarak 0,05 OD600 Onkoloji ile. Şişeler dedektörleri yerleştirin ve 28 ° C, 130 rpm ve % 80 nem salla.Not: Ölçüm önlemek için başlangıç şişeye altına yapıştırma ve yanlış değerleri verimli hücrenin kültür sallayarak, 5 min vermek çok önemlidir. Ölçüm başlamak belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde tıklatın. Hücre yoğunluğu ölçüm 4 h sonra aşılama ve karbon kaynağı alır (4.7 adımda açıklanan belirlenmesi) tükenmiş için 0.2 mL numune al triplicates içinde. Yetiştirme ortamı (ilk ölçüm 1:5, ikinci ölçüm 1:20) uygun şekilde örneklerinde sulandırmak ve 600 nm dalga boyu emme bir spektrofotometre de ölçün. Şişeler çıkarmadan önce ve shaker durdurmadan önce bile, her zaman belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde ölçüm duraklatın.Not: Dedektörleri parametreler tanımlanmış sallayarak koşullar altında kaydetmek için kalibre edilmiş ve saçma ölçümleri için hala kültürler kaydederken verecektir. Ayrıca, her zaman tekrar ölçüm başlamadan önce sallayarak, 5 min beklemek emin olun. Dedektör biyokütle ve gerçek olmayan hücre yoğunluğu için sadece değerleri teslim çünkü hücre yoğunluk ölçümleri gereklidir. OD600 değerler arasında bir kalibrasyon fonksiyonu (x değeri) ve online ölçüm sistemi (y değerleri) tarafından elde edilen değerler birkaç timepoints spectrophotometrically ölçerek elde edilebilir. Bir doğrusal ancak de aşağıdaki kalibrasyon işlevine göre logaritmik bir ilişki değerlerdir:y: OD600 değerleri spektrofotometre tarafından eldex: online ölçüm sistemi tarafından elde edilen değerlerk: yamaçd: ekseni kesişim noktasıEğim ve eksen kesişim noktası daha sonra herhangi bir değeri karşılık gelen OD600 değeri dönüştürmek için kullanılabilir. Excel’de bir spectrophotometrically elde edilen OD600 değerler aynı timepoint online sistemden gelen değerler karşısında çizebilirsiniz. Logaritmik bir eğilim çizgisi ve karşılık gelen denklem eklenmesi yukarıda gösterilen kalibrasyon fonksiyonu verecektir. Karbon kaynağı neredeyse tükenmiş (app. 12-20 h) kadar yetiştirmek. Bu amaçla, oksijen konsantrasyonu sıfır yaklaşıyor ve hücreleri üstel büyüme aşamasındadır yazılım diyagramları görülebilir kadar büyümek kültürler izin.Not: Bu protokol için kullanılan karbon kaynağı konsantrasyonları için durum böyle. Bu exemplarily temsilcisi sonuçlar bölümünde, Şekil 1 ‘ deki oksijen seviyesini sıfır yaklaşımlar ve üstel büyüme hücrelerdir görüldüğü gibi karbon kaynak tükenmesi timepoint online izleme sistemi ile belirlenebilir aşama. 5. protein ifade de-baskı tarafından Adım 4,6 içinde açıklanan timepoint ulaşıldığında, steril koşullarda şişesi başına dört besleme diskler eklenmesiyle kültürler besleme başlatın.Not: açıklanan koşullar söz konusu olduğunda, dört gliserol besleme diskler sürüm 2 mg/h gliserol üreticiye göre. Seçim bir tahlil tarafından protein ifade izlemek için her 24 h örnekleri fotoğraf çekerken tarım 60-90 h için devam (e.g., Bradford tahlil15, SDS sayfa16 veya etkinlik deneyleri) ve hücre yoğunluk ölçümleri. 6. kültür hasat Yetiştirme 60-90 h sonra 4.000 x de g, 4 ° C’de 10 dakika aralıklarla tarafından ürün toplama 50 mL santrifüj tüpleri kültürlerde doldurun.Not: Süpernatant (için salgılanan proteinler) veya hücreleri (hücre içi protein ifade) tarafından 4.000 x de g, 4 ° C’de 10 dakika aralıklarla hasat edilebilir ve daha fazla analizler yapılabilir. Online ölçüm verileri yazılım daha ayrıntılı analiz için bir elektronik tablo dosyası olarak verin. 5-10 mL distile su tüm şişeler ve otoklav kalan hücreleri devre dışı bırakabilirsiniz doldurun.

Representative Results

Protokol bölümünde açıklandığı gibi yazılım önemli ekimi parametreleri üzerinde tüm yetiştirme kaydeder. Şekil 1 görselleştirme biyokütle gelişme ve oksijen konsantrasyonu % 0,5 (Şekil 1A) ya da % 0,3 (Şekil 1B) karbon kaynağı diskler yem gliserol eklenmesi tarafından takip toplu iş ile başladı bir ekimi sırasında gösterir. Toplu işlem tam olarak belirlenebilir sonra online izleme sistemi karbon kaynak tükenmesi timepoint de-bastırılmış arazisi için özellikle yararlıdır. Şekil 1′ de görüldüğü gibi orta oksijen konsantrasyonu hızla düşüyor ve sıfıra, özellikle için % 0,5 gliserol toplu iş (iken biyokütle bu noktada katlanarak artmaktadırŞekil 1A). Burada, üstel büyüme aşamasında hücrelerdir ve iletişim kuralında açıklandığı kısa bir süre kültür durağan faz ulaşmadan karbon kaynağı serbest bırakmak en iyi yararlanmak için besleme diskler eklenmelidir. Oksijen konsantrasyonu sıfır ulaşmadan önce besleme diskler eklenmesi de-bastırılmış protein ifade hücreleri oksijen sınırlama gelen önlemek için önemlidir. O Şekil 1B adımında görülebilir ve bu nedenle de-bastırılmış protein ifade için tavsiye edilir düşük gliserol konsantrasyonlarda kısa süreli oksijen sınırlamalar etkisini azaltmak. Aşağıda, iki farklı yetiştirme-istihdam açıklanan protokol ve izleme sistemi 1 rakam gösterilir-deneyler açıklanan sonuçlar. İlk denemede, glikoz oksidaz Aspergillus niger (A. niger) üzerinden PDC ve ikinci kontrol altında insan büyüme hormonu üreten P. pastoris zor üreten bir P. pastoris yük PDF kontrolü altında gösterilir. Bu deneyde, glikoz oksidaz üretim PDC kontrol altında araştırılmıştır. Bu nedenle, farklı yetiştirme stratejileri karşılaştırıldı: gliserol darbe, sürekli gliserol besleme diskler ve yetiştirme olmadan herhangi bir besleme veya nabız gibi atan eklenmesi tarafından besleme. Ekimi tek karbon kaynağı olarak 250 mL sallamak şişeler (Tablo 1) 50 mL arabelleğe alınan en az medya % 0.5 glukoz ile yapıldı. 160 h ekimi, üzerine yüksek biyokütle konsantrasyonu elde edilmiştir, biyokütle üretimi (38 h) ve (% 0,25 w/v gliserol 38 h, 61 h ve 86 h ekimi sonra) gliserol darbe için bir glikoz toplu iş kullanarak bir beslenme stratejisi ne zamandı (0,21 g/M salgı toplam istihdam protein, 8.4 U/mL). Logosuna 2 kat azalma biyokütle konsantrasyonu ve salgılanan protein toplam miktarı elde rağmen besleme diskleri 38 h glikoz toplu iş iş sonra eklendiğinde, hatta 1 U/gliserol darbe kullanarak ekimi için karşılaştırıldığında mL daha yüksek hacimsel etkinliği oldu . Bu salgılanan protein önemli bir miktar hacimsel etkinliğinde süpernatant için katkı sağlamamaktadır ve etkin bir biçimde salgılanan gösterir. Bu nedenle, daha yüksek gliserol konsantrasyonları düşük gliserol bakliyat görünüşte biyokütle yerine hedef protein üretim ve sürekli düşük gliserol yayın daha fazla iki kat daha yüksek özel verimlilik için liderliğindeki oluşumu lehine. Başka bir deneme de-bastırılmış ifade yöntemle contalı profillerde PDFkontrol altında insan büyüme hormonu (hGH) ifade ederek yapıldı. Yapı stabil P. pastoris zorlanma BSYBG11 genom entegre edildi. Burada, BYPG, 50 mL arabelleğe alınmış zengin Orta, 250 mL şaşkın sallamak şişeler kullanıldı % 0,3 (w/v) gliserol ile karbon kaynağı bir toplu iş olarak. Gliserol tükenmesi sürekli gliserol yem protein ifadesiyle 4 şişe diskler yem ve yem (Şekil 2) hiçbir gliserol karşılaştırıldığında eklenmesiyle sağlanmış. Şekil 2 hGH ifade ve ekili ve sürekli gliserol yem olmadan aynı soy biyokütle gelişimi arasında karşılaştırma gösterir. Tahlil sandviç ELISA HRP için erimiş ikincil antikor ile kullanılan ve algılama gerçekleştirildiği 3,3′, 5, 5 ‘-tetramethylbenzidine (TMB) substrat olarak ile. Özellikle bu protein, kasanın yanında besleme, bu bozulma olabilir, ancak herhangi bir besleme olmadan hücreleri üretilen protein yaklaşık 30 h (ışık mavi kareler), sonra aşağılamak başlar engelledi (koyu mavi üçgen) gibi görünüyordu ve hatta protein konsantrasyonu biyokütle başına hala ekimi 150 h sonra arttı. Hansenula polymorpha14olarak pek gözlenen zaten, bu sonucu nasıl P. pastoris arazisi optimize edebilirsiniz genellikle sallamak şişesi ölçekte, beslenen-toplu modu için kullanılır gibi toplu iş, geçiş gösterir. Şekil 1: görselleştirme Online sırasında iki arazisi ile farklı gliserol konsantrasyonları toplu iş parametreleri kaydedildi. Arazisi % 0,5 w/v(a)ve % 0,3 w/v (B) gliserol toplu iş başına şişesi 4 besleme diskler uygulayarak beslenen nerede hücreleri de-baskı aşaması gelir ile başlanmıştır (Yayın oranı 0.5 mg/h/disk üreticiye göre). Sürekli satırlar hücre yoğunluğu (OD600) gösterir, ancak kesik çizgiler ortamda oksijen konsantrasyonu göster. Hata çubukları altı standart sapması çoğaltır (2 biyolojik, üç teknik her) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: toplu iş ve beslenen-toplu iş modunda insan büyüme hormonu (hGH) ifade karşılaştırılması. hGH içerik 405 emme değerlerinde belirttiği nm nerede bir HRP fusion 2nd antikor olduğunu ve TMB algılaması için bir substrat kullanılan bir ELISA tarafından. İki farklı kültür için sonuçları gösterilmiştir: ışık mavi çizgi ve kareler görüntü hücre yoğunluğu ve nerede gliserol yem diskler bir kültüre göre toplu sonra herhangi bir yayın olmadan bir kültürün hücre yoğunluğu tarafından normalleştirilmiş hGH konsantrasyonu (koyu mavi çizgiler ve üçgenler) uygulanır. Hata çubukları altı standart sapması çoğaltır (2 biyolojik, üç teknik her) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. PDC- GOX 160 h ekimi saat OD600 Vol. etkinlik [U/mL] salgılanan protein [mg/mL] toplam tutar hücre yoğunluğu hacimsel yansıtılmasında Demek SD Demek SD Demek SD Demek BMD1% toplu + gliserol darbe 74,6 2 8.4 2.4 0.21 0,01 0,11 BMD1% toplu + sabit gliserol besleme 32.5 0,3 9,4 0,7 0,09 0,01 0,29 BMD1% toplu 18,8 0,6 3.7 0,7 0,01 0 0,2 Tablo 1: de-bastırılmış Düzenleyicinin kontrolü altında metanol bağımsız GOX ifadenin sonuçlarını PDC .

Discussion

Bu yöntem güvenilir bir protokolü için verimli metanol bağımsız indüklenebilir ifade tarafından P. pastoris PAOX112tarafından tahrik klasik metanol indüklenen protein ifade bir alternatif olarak sunar. De-repressible rehberleri,DCP, PDF veya yukarıda açıklanan mutasyona uğramış PAOX1 türevleri17, gibi bu yeni protein üretim kavramı moleküler temeli oluşturmak. Gösterilen temsilcisi sonuçları kullanışlılığı ve P. pastoris Rekombinant protein ifadesinde de-bastırılmış rehberleri ve basit online izleme ile küçük ölçekli tarama tarafından pratiklik altını çizin. Bir yandan AOX1 organizatörü indüksiyon için genellikle kullanılan zararlı ve zehirli metanol ekimi ortadan kaldırılabilir. Öte yandan, bünye protein ifade, Örneğinaksine edilişi9 büyüme ve protein üretim aşaması vardır., yaygın olarak kullanılan PGAPile. Bu özellikle yararlı olduğunda hücreleri bir yük gosterir toksik veya zararlı proteinler hızlı.

Arazisi farklı karbon kaynağı konsantrasyonları ile başlatmak için olasılığı bir protein üretim aşamasında daha önce kazanmak istiyorum ne kadar biyokütle başlama kararı sağlar. Öte yandan yüksek hücre yoğunluğu da daha yüksek protein titreleri neden olabilir süre bir düşük karbon kaynağı yoğunluklu toplu iş iş işlemde seçerken, oksijen transfer sınırlamaları çok yüksek hücre yoğunluğu nedeniyle azaltılabilir. Şekil 1‘ de gösterildiği biyokütle üretimi ve oksijen konsantrasyonları açısından kültür geliştirme izleyerek, beslenen-toplu iş başlangıç için en uygun zaman noktası kolayca belirlenebilir.

Online bu işleme parametrelerini izlemek için bir uygun ölçüm sistemi uygulanması gerekir. Ölçüm cihazı (Örneğin, SFR Vario) biyokütle basit ve ekonomik online ölçüm sistemi kültür izleme için sallamak şişeler. Opto-elektronik okuyucu yolu ile dağınık ışık algılama şişeye hücre büyüme belirler ve şişeye entegre oksijen sensörü sinyal dışarı okur. Biyokütle ölçüm için optik parçacıklar kültür suyu (hücreler) tarafından dağınık ve bir fotodiyot ile tespit bir ışık sinyali yayan bir LED oluşur. Optik sensörleri belirli bir dalga boyu ışıkla heyecanlı zaman floresans yayarlar. Analit molekülleri mevcut miktarına bağlı olarak, bu floresan sinyal, hangi okuyucu optik tarafından algılanır ve konsantrasyon değerleri değiştirir. Ancak, bir hücre yoğunluğu ölçüm kalibrasyon ölçüm sistemi gerçek OD600 değerleri ölçme değil beri önceden, kurulacak vardır. Oksijen alımını oranı üzerinden reader yazılımı ile oksijen eğrisi eğimi hesaplanabilir ve sıcaklık gibi rpm sürekli diğer parametreler ile birlikte kaydedilir. Bu sistem ile izlemeyi etkinleştir için sallamak şişeler daha önce istenen parametreler için uygun sensörleri ile donatılmış olması gerekir.

Dört yavaş salımlı polimer eklenmesiyle diskler, gliserol kültür suyu için sabit bir miktarını sağlama biyokütle birikimi neredeyse durdu ve Rekombinant protein üretim devam etmektedir. Besleme disk ek zaman noktası belirlenmesi önemli bir adım bu deneyde değil, ama ifade üzerine başlar üstel büyüme aşamasında önce erken bir besleme başlangıç organizatörü aktivasyon inhibe düşünülmelidir karbon kaynak tükenmesi. Ayrıca, oysa sonra hücreleri durağan faz ulaştınız yem geciktirmek için açlıktan neden olabilir ve bozulma zaten protein üretilen yemek zamanı polimer kapasite sınırlamaları nedeniyle toplam azalabilir. Besleme diskler bu protokol için kullanılan miktarı deneysel organizatörü biyokütle üretimi düşük (veri gösterilmez) tutarken de-baskı altında tutmak en iyi karbon kaynağı sürülmesi tespit edilmiştir. Bu şekilde, arazisi olabilir 160-180 h herhangi bir müdahale olmadan kolayca üzerinden gerçekleştirilen.

Bu yeni protokol ana uygulamalar eleme ifade klon, enzim evrim ve keşif, karakterizasyonu ve mühendislik yeni Rehberleri metanol-Alerjik ekimi Protokolü iyi izlenen koşullarında istihdam olacaktır. Prensip olarak, aynı iletişim kuralını metanol ve sınırlı fermantatif karbon kaynağı beslemeleri gibi Panula-Perälä ve arktarafından açıklanan istihdam karışık-besleme stratejileri için uygulanabilir olmalıdır. 2014 yılında18.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ROBOX Avrupa Birliği (AB) proje ROBOX (Hibe Sözleşmesi n ° 635734) Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 programı araştırma ve yenilik altında eylemler H2020-LEIT biyo-2014-1 fon aldı. Görüş ve ifade burada fikir yalnızca o yazar(lar) ve mutlaka bu Avrupa Birliği Araştırma Ajansı yansıtmamaktadır. Avrupa Birliği’nin burada yer alan bilgiler yapılan herhangi bir kullanım için sorumlu değildir.

Doktora tezi ile J. Fischer bir grant tarafından Avusturya finansman Kurumu’nun işe FFG “tez için Industrienahe” ortak finanse edilmektedir.

Biz yararlı tartışmalar ve el yazması taslak için değerli giriş Gernot John (PreSens GmbH) teşekkür ederim.

Materials

Bacto Yeast Extract BD Biosciences 212720
Baffled Flask 250 mL DWK Life Science 212833655
BBL Phytone Peptone BD Biosciences 298147
BioPhotometer Eppendorf AG 5500-200-10
Certoclav-EL CertoClav GmbH 9.842 014
Difco Yeast nitrogen base w/o amino acids BD Biosciences 291920
Feed discs glycerol Adolf Kuhner AG 315060
Glucose-monohydrate Carl Roth GmbH + Co. KG 6887
Glycerol ≥98 % Carl Roth GmbH + Co. KG 3783
K2HPO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 6875
KH2PO4 Carl Roth GmbH + Co. KG 3904
Multitron Standard  Infors AG 444-4226
SFR Vario v2 PreSens GmbH 200001689
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bill, R. M. Playing catch-up with escherichia coli: Using yeast to increase success rates in recombinant protein production experiments. Frontiers in Microbiology. 5 (MAR), 1-5 (2005).
  2. Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris). Molecular Biotechnology. 16, 23-52 (2000).
  3. Weinhandl, K., Winkler, M., Glieder, A., Camattari, A. Carbon source dependent promoters in yeasts. Microbial Cell Factories. 13, 5 (2014).
  4. Vogl, T., Kickenweiz, T., Sturmberger, L., Glieder, A. Bidirectional Promoter. US patent. , (2005).
  5. Vogl, T., Glieder, A. Regulation of Pichia pastoris promoters and its consequences for protein production. New Biotechnology. 30 (4), 385-404 (2013).
  6. Rußmayer, H., et al. Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology. 13 (1), 80 (2015).
  7. Sakai, Y., Yurimoto, H., Matsuo, H., Kato, N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii. Yeast. 14 (13), 1175-1187 (1998).
  8. Hartner, F. S., Glieder, A. Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microbial Cell Factories. 5, 39 (2006).
  9. Vogl, T., et al. A Toolbox of Diverse Promoters Related to Methanol Utilization: Functionally Verified Parts for Heterologous Pathway Expression in Pichia pastoris. ACS Synthetic Biology. 5 (2), 172-186 (2016).
  10. Mellitzer, A., Weis, R., Glieder, A., Flicker, K. Expression of lignocellulolytic enzymes in Pichia pastoris. Microbial Cell Factories. 11 (1), 61 (2012).
  11. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  12. Weis, R., Luiten, R., Skranc, W., Schwab, H., Wubbolts, M., Glieder, A. Reliable high-throughput screening with Pichia pastoris by limiting yeast cell death phenomena. FEMS Yeast Research. 5 (2), 179-189 (2004).
  13. Ukkonen, K. . Improvement of Recombinant Protein Production in Shaken Cultures. , (2014).
  14. Jeude, M., et al. Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnology and Bioengineering. 95, 433-445 (2006).
  15. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  16. Smith, B. J. SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins. Methods in molecular biology. 1, 41-55 (1984).
  17. Hartner, F. S., et al. Promoter Library Designed for Fine-Tuned Gene Expression in Pichia Pastoris. Nucleic Acids Research. 36 (12), e76 (2008).
  18. Panula-Perälä, J., Vasala, A., Karhunen, J., Ojamo, H., Neubauer, P., Mursula, A. Small-scale slow glucose feed cultivation of Pichia pastoris without repression of AOX1 promoter: towards high throughput cultivations. Bioprocess and Biosystems Engineering. 37 (7), 1261-1269 (2014).

Tags

Pichia PastorisMethanolDe-repressionRecombinant Protein ExpressionShake Flask CultivationOnline MonitoringBiomass MeasurementBluetoothCell DensityGlycerol FeedExponential Growth Phase

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fischer, J. E., Hatzl, A., Weninger, A., Schmid, C., Glieder, A. Methanol Independent Expression by Pichia Pastoris Employing De-repression Technologies. J. Vis. Exp. (143), e58589, doi:10.3791/58589 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image